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Analyse von DNA- und RNA-Modifikationen durch Fluoreszenz-Postlabeling mit BODIPY und Kapillarelektrophorese mit Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion

Cornelius, Michael Günter

English Title: Analysis of DNA and RNA modifications using fluorescence postlabeling and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection

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PDF, German
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Abstract

90% aller Substanzen, die beim Menschen Krebs auslösen, verursachen strukturelle Veränderungen an der DNA, sie wirken genotoxisch durch Bildung von Addukten bzw. Modifikationen. Diese DNA-Modifikationen können endogenen oder exogenen Ursprungs sein. Die Detektion und Analyse von DNA-Modifikationen ist daher von großer Bedeutung, nicht nur für die Bestimmung der biologisch effektiven Dosis der genotoxischen Substanz, sondern auch für die Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Exposition und Krebsrisiko. Da DNA-Addukte in vivo nur in geringen Konzentrationen auftreten, ergeben sich höchste Anforderungen an eine Analysen-Methode zu ihrem Nachweis. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zum Nachweis von DNA- und RNA-Modifikationen entwickelt und validiert. Sie beruht auf der enzymatischen Hydrolyse von DNA bzw. RNA zu Nukleosid-5’-Monophosphaten, deren chemischer Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (BODIPY-FL-EDA), sich anschließender Trennung mit mizellarer elektrokinetischer Chromatographie und Laser-induzierter Fluoreszenzdetektion (CE-LIF). Zur Methodenentwicklung wurden sowohl synthetische Standardverbindungen der Modifikationen, modifizierte 2’-Desoxy- und Ribo-Oligonukleotide, als auch definiert modifizierte Lambda-DNA eingesetzt. Die neue Methode ist in der Lage verschiedene, durch oxidativen Stress und Deaminierungen verursachte DNA-Modifikationen (8-Oxo-Guanin, 8-Oxo-Adenin, Uracil, Inosin), sowie die epigenetisch interessanten Methyl-Modifikationen von Cytosin und Adenin (5-Methylcytosin, N6-Methyladenin) mit hoher Präzision, Selektivität und Empfindlichkeit nachzuweisen. Die Nachweisgrenze der DNA-Modifikationen lag bei 100pM (50attomol, 3 Addukte je 107 normale Nukleotide) für N6-Methyladenin, 200pM (ca. 100attomol, 6 Addukte je 107 normale Nukleotide) für Uracil und Inosin und 1nM für 8-Oxo-Guanin und 8-Oxo-Adenin (3 Addukte je 106 normale Nukleotide), die der RNA-Modifikationen bei 80pM (40attomol, 2 Addukte je 107 normale Nukleotide) für Pseudouracil und 2’-O-Methyladenin. Die schlechtere Detektierbarkeit der Guanin-Modifikationen konnte auf eine basenspezifische Fluoreszenzlöschung des Farbstoffes zurückgeführt werden. Mit der validierten Methode wurden verschiedene Basenmodifikationen in in vitro modifizierter Kalbsthymus-DNA und der Anteil der natürlich vorkommenden, seltenen Base Pseudouracil in RNA verschiedener Organismen bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Analysenbedingungen der älteren Variante der Methode, die auf dem Verdau von DNA zu 2’-Desoxynukleosid-3’-Phosphaten mit anschließender Fluoreszenzmarkierung und CE-LIF Analyse beruht, optimiert. Hiermit gelang es verschiedene Deaminierungsprodukte und oxidative Schäden in in vitro behandelter Kalbsthymus-DNA zu bestimmen. In Bezug auf ihre Empfindlichkeit und Genauigkeit erwiesen sich beide Varianten als gleichwertig. Des Weiteren wurde speziell für N6-Methyladenin eine Analysenmethode ausgearbeitet und validiert, und so der Adenin-Methylierungsgrad von Lambda-DNA aus Wildtyp E. coli bestimmt (0.59%).

Translation of abstract (English)

90% of all substances that cause cancer in humans are genotoxic by exerting their biological effects through the formation of structural changes of DNA, so called DNA modifications or DNA adducts. Detection and analysis of these DNA modifications resulting from endogenous or exogenous exposures to carcinogens is essential not only for quantifying biologically effective doses, but also for establishing relationships between exposure and cancer risk. Since DNA adducts are only present in minute quantities in vivo, analytical methods for their detection have to meet high demands. In this work a new analytical method for the detection of DNA and RNA modifications was developed and validated. The method is based on enzymatic hydrolysis of DNA or RNA to nucleoside-5’-monophosphates, chemical derivatization with a fluorescent dye (BODIPY-FL-EDA) and subsequent separation by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (CE-LIF). Method development was carried out using synthetic DNA adduct standards, modified 2’-deoxy- and ribooligonucleotides as well as defined modified lambda-phage DNA. The new method has the ability to detect a wide range of DNA modifications caused by oxidative stress and deamination (8-oxo-guanine, 8-oxo-adenine, uracil, inosine) as well as the epigenetically important methyl modifications of cytosine and adenine (5-methylcytosine, N6-methyladenine) with high precision, selectivity and sensitivity. The limit of detection for the examined DNA modifications was found to be in a range from 100pM (ca. 50attomole, 3 adducts per 107 normal nucleotides) for N6-methyladenine, 200pM (ca. 100attomole, 6 adducts per 107 normal nucleotides) for uracil and inosine to 1nM for 8-oxo-guanine, 8-oxo-adenine (3 adducts per 106 normal nucleotides). For RNA modifications the limit of detection was approximately 80pM (40attomole, 2 adducts per 107 normal nucleotides) for pseudouracil and 2’-O-methyladenosine. The higher detection limit for modifications of the nucleobase guanine could be ascribed to a base specific fluorescence quenching effect. The validated method was used to detect various base modifications in in vitro modified calf thymus DNA and to determine the amount of the naturally occurring rare base pseudouracil in RNA of different organisms. In the second part of this thesis the separation conditions of an older version of the fluorescence postlabeling method, which is based on DNA digestion to 2’-deoxnucleoside-3’-monophosphates, fluorescence labeling with BODIPY-FL-EDA and CE-LIF analysis, was optimised. Using the modified procedure different deamination products and oxidative damage in in vitro modified calf thymus DNA were determined. Both versions of the fluorescence postlabeling method turned out to be equally efficient and sensitive. Furthermore an analytical method for the detection of N6-methyladenine was devised and validated. Using this method it was possible to quantify the methylation level of adenine in lambda DNA of wild-type E. coli (0.59%)

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schmeiser, PD Heinz H.
Date of thesis defense: 4 May 2006
Date Deposited: 08 May 2006 14:16
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Kapillarelektrophorese, Laserinduzierte Fluoreszenz, Analytische Methode
Uncontrolled Keywords: DNA-Addukte , DNA-Methylierungcapillary electrophoresis , laser-induced fluorescence , DNA adducts , DNA methylation , analytical method
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