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Analyse der Carboxypeptidase D-unabhängigen und -abhängigen Schritte bei der Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus der Ente

Schmut, Nicole

English Title: Analysis of Carboxypeptidase D-independent and -dependent steps in the duck hepatitis B virus infection

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PDF, German
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Abstract

Das Hepatitis-B-Virus der Ente (DHBV) zählt zur Familie Hepadnaviridae, einer Gruppe umhüllter DNA-Viren, die sich durch eine enge Wirts- und eine vorwiegend auf Hepatozyten beschränkte Gewebespezifität auszeichnen. Diese doppelte Restriktion im Tropismus wird in erster Linie durch die frühen Schritte des viralen Lebenszyklus bestimmt: (i) die Bindung des Virions an Rezeptormoleküle auf der Oberfläche der Wirtszelle, (ii) die endozytotische Aufnahme in die Zelle und (iii) die anschließende Membranfusion, die zur Freisetzung des Nukleokapsids in das Zytoplasma führt. DHBV kann sowohl in vivo in der Pekingente als auch in vitro in primären Entenhepatozyten (PDH) leicht propagiert werden und stellt deshalb ein unverzichtbares Modellsystem dar, die frühen Schritte der hepadnaviralen Infektion zu entschlüsseln. Eine essentielle Funktion hierbei wohnt der preS-Domäne des großen viralen Hüllproteins inne. Als zellulärer preS-Interaktionspartner ist die Carboxypeptidase D der Ente (dCPD) beschrieben. Sie bindet in einem ungewöhnlichen 2-Stufen-Mechanismus zunächst mit niedriger Affinität an einen Bereich innerhalb von preS (AS 86 - 115), der eine amphipathische alpha-Helix umfasst, und dann linear fortschreitend an N-terminal davon gelegene Aminosäuren (AS 30 - 85), woraus sekundär ein hochaffiner Komplex resultiert. Um die funktionelle Bedeutung der Interaktion von preS mit dCPD zu untersuchen, wurden Punktmutationen in die alpha-Helix eingeführt, die entweder zur Änderung der Ladungsverteilung oder der Aufhebung der strukturellen Integrität führten. Der Phänotyp dieser preS-Mutanten wurde biochemisch bezüglich der dCPD-Bindefähigkeit charakterisiert: während die Änderung der Amphipathizität ohne Auswirkung blieb, führte die Störung der Helixstruktur zu einer drastischen Reduktion oder zu einem vollständigen Verlust der dCPD-Interaktion. Der Verlust der dCPD-Bindekompetenz war streng korreliert mit einer Aufhebung der Infektiosität der entsprechenden Viren auf PDHs. Erstaunlicherweise wurden diese Defektmutanten unvermindert von Hepatozyten gebunden und internalisiert. Diese Ergebnisse bestätigen die essentielle Funktion der dCPD bei der DHBV-Infektion, sprechen aber gegen eine Rolle als exklusiver Binde- und Aufnahmerezeptor. Synthetische myristoylierte Peptide, die den N-Terminus des preS (AS 2 - 41) umspannen, kompetitieren äußerst effizient mit der DHBV-Infektion. Um den hierbei adressierten Schritt beim Viruseintritt näher zu definieren, wurden gegen die Peptide gerichtete Antikörper generiert. Diese konnten sowohl virale Partikel präzipitieren als auch ihrerseits selbst die Infektion blockieren, obwohl das von ihnen erkannte Epitop (AS 12 - 23) nicht mit der dCPD-Binderegion überlappt und in vitro keine Interferenz mit der dCPD-Interaktion nachweisbar war. Hieraus lässt sich folgern, dass der N-terminale preS-Bereich einen distinkten Schritt beim Viruseintritt vermittelt, der von der preS-dCPD-Komplexbildung funktionell klar abgrenzbar ist In DHBV-infizierten Entenlebern findet sich regelmäßig eine verkürzte Variante des großen viralen Hüllproteins. Durch die massenspektrometrische Analyse dieser Variante konnte eine putative Proteaseschnittstelle in der preS-Domäne unmittelbar nach den Argininen an Position 71 und 72 identifiziert werden. Der Austausch beider Aminosäuren führte zu einem vollständigen Verlust der Infektiosität ohne die Bindefähigkeit an dCPD und Hepatozyten zu beeinträchtigen. Dieser Befund impliziert eine proteolytische Prozessierung des großen Hüllproteins als notwendigen Teilschritt des Eintrittgeschehens. Aus den erhobenen Daten lässt sich ein mehrstufiges Modell des Eintritts von DHBV in die Wirtszelle ableiten. Das Virus bindet zunächst an einen bislang unbekannten Faktor auf der Hepatozytenoberfläche. Nach der Internalisierung erfolgt obligat der preS-abhängige Transfer auf dCPD. Die postulierte proteolytische Prozessierung könnte anschließend zur Freisetzung eines fusiogenen Peptids führen, dessen Aktion durch die homologen synthetischen Peptide inhibiert wird.

Translation of abstract (English)

The Duck Hepatitis B Virus (DHBV) belongs to the Hepadnaviridae family, a group of enveloped DNA viruses which reveal a narrow host range and mainly on hepatocytes restricted tissue tropism. This double restriction in the tropism is primarily specified by the early steps in the viral life cycle: (i) binding of the virion to receptor molecules on the surface of the host cell, (ii) endocytotic uptake into the cell and (iii) the resulting fusion with the cellular membrane liberating the capsid into the cytoplasm. DHBV can easily be propagated in vivo in the Pekin duck as in vitro in primary hepatocytes (PDH) and therefore is an invaluable model system for studies on the early steps of the hepadnaviral infection. Thereby the preS domain of the large viral envelope protein plays an essential role. The duck Carboxypeptidase D (dCPD) is characterized as a cellular preS interaction partner. dCPD binds with low affinity to the amphipathic helix containing element amino acids 86 to 115 in the preS and then sequentially to N-terminally located amino acids (amino acids 30 to 85) resulting secondarily in a high affinity complex. To study the functional importance of this preS interaction with dCPD, we introduced point mutations into this alpha-helix which either lead to a change of charges or to the loss of the structural integrity. The phenotype of the respective mutants regarding their dCPD-binding capacity was biochemically characterized: whereas altering the amphipathicity remains without any consequences, results disturbing the helical structure in a drastic reduction or in a complete loss of dCPC-interaction. The loss of dCPD-binding competence correlated strictly with cancellation of infectivity of the respective virus on PDHs. Remarkably, hepatocytes bound and internalised undiminishedly these defective mutants. These obtained results corroborate the essential role of dCPD in DHBV infection but disprove clearly its previous postulated function as primary binding- and uptake-receptor. Synthetic myristoylated peptides comprising the N-terminus of the preS (amino acids 2 to 41) compete extremely efficiently with the DHBV infection. To define the addressed step in the viral entry, antibodies directed against these peptides were generated. These antibodies could as well precipitate viral particles as well as block themselves the infection although antibody binding site (amino acids 12 to 23) does not overlap with the dCPD binding domain and in vitro no detectable interference with dCPD interaction. Thereby it can be concluded that the N-terminal preS part mediates a distinct step in the viral entry which is clearly separated functionally of the preS-dCPD-complex formation.A shortened variant of the large viral envelope protein is regularly found in DHBV-infected duck livers. Mass spectrometric analysis identified a putative cleavage site in the preS-domain after the Arginines at position 71 and 72. Exchanging both amino acids resulted in a loss of infectivity without any consequences on binding capacity to dCPD and hepatocytes. This result implies a proteolytic processing of the large viral envelope protein as one essential step in viral entry. From the collected data a multi-stage model of DHBV entry into the host cell can be derived. The viral particle binds a yet unknown factor on the surface of the hepatocytes. Internalisation is followed by the obligatory preS-dependent transfer to dCPD. The postulated proteolytic processing results finally in liberating a fusiogenic peptide which action is inhibited by homologous synthetic peptides.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Urban, Dr. rer. n Stephan PD
Date of thesis defense: 15 May 2006
Date Deposited: 08 Jun 2006 07:40
Date: 2006
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Hygiene-Institut
Subjects: 610 Medical sciences Medicine
Controlled Keywords: Hepatitis-B-Virus, Hepatitisvirus
Uncontrolled Keywords: Hepatitis-B-Virus der Ente , Carboxypeptidase D , Viruseintritt , proteolytischer SchnittDuck hepatitis B virus , duck Carboxypeptidase D , virus entry
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