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The Protein-protein Interaction Map of the Treponema pallidum Flagellar Apparatus

Rajagopala, Seesandra Venkatappa

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Abstract

Diese Studie stellt den ersten umfassenden Versuch dar, die Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) eines bakteriellen Flagellenapparats genomweit zu erfassen. Wir haben dafür Treponema pallidum ausgewählt, also Spirochäten, die auch die Syphilis auslösen. T. pallidum hat ein kleines Genom mit nur 1,041 Genen, die alle in klonierter Form vorliegen. Die Flagellen von Spirochäten besitzen ausserdem einige spezielle Eigenschaften wie die periplasmatische Lokalisation der zwei polaren Flagellenbündel, welche sie für vergleichende Analysen besonders interessant machen Im Lauf dieses Projekts habe ich eine Yeast two-hybrid-Bibliothek des Treponema pallidum-Proteoms konstruiert und damit umfassende genom-weite Screens mit allen 75 Flagellen- und Motilitäts-Proteinen durchgeführt. Insgesamt wurden dabei 268 PPIs zwischen 174 verschiedenen Proteinen identifiziert. Davon waren zuvor nur 15 homologe Interaktionen (“Interologe”) aus der Literatur bekannt. Um die funktionelle Bedeutung dieser neuen Interaktionen für die bakterielle Motilität zu untersuchen, habe ich zuerst 23 Orthologe aller Treponema-Interaktoren in E. coli und 30 in B. subtilis vorhergesagt. Die Gene von 23 Orthologen wurden dann in E. coli und/oder B. subtilis (7 Gene) mutiert und deren Phänotyp in Motilitätsassays überprüft. Ich fand dabei 10 neue Proteine in E. coli (amiA, bcsC, rfaH, rpe, rpmJ, ycfH, yciM, yggH, yggW, und yncE) und 5 Proteine in B. subtilis (yaaT , yhbE/YhbF, yllB, yloS und yviF), deren Treponema-Homologe mit Flagellenproteinen interagierten und deren Mutanten einen Motilitätsphänotyp zeigen. Aufgrund ihrer Interaktionen und Phänotypen konnte ich 8 bisher nicht charakterisierten Proteinen eine Rolle als Motilitätsgene zuordnen, und zwar TP0046 (yaaT), TP0048 (yhbE/yhbF), TP0383 (yllB), TP0421 (yncE), TP0561 (ydjH), TP0658 (yviF), TP0712 (HP1034) and TP0979 (tatD). Basierend auf den 268 two-hybrid-Interaktionen konnte ich ausserdem 1455 Interaktionen in 30 anderen Bakterien vorhersagen. Mit 35 Flagellenproteinen von 30 Bakterienarten habe ich ausserdem einen phylogenetischen “Super-Stammbaum” erstellt, der die Flagellenapparate in einen evolutionären Kontext stellt und belegt, dass die Spirochäten einen ungewöhnlichen und abgeleiteten Flagellenapparat aufweisen. Ein Protein unbekannter Funktion, TP0658 (yviF in B. subtilis) wurde näher untersucht. Die Y2H-Interaktionen von TP0658 mit Flagellinen (flaB1-3) wurden biochemisch verifiziert. TP0658 bindet an eine C-terminale Sequenz von FlaB1 zwischen L231 und D247 (dem so genannten C-Loop der Flagelline). Dieses epitop ist in B. subtilis und anderen Bakterien konserviert. Ein hochkonserviertes Asparagin (N237 in FlaB1 bzw. N255 in B. subtilis hag) ist entscheidend für die Bindung. Eine ΔyviF Mutante in B. subtilis hatte einen starken Motilitätsphänotyp und keine nachweisbaren Flagelline. Koexpression von TP0658 und FlaB1 in E. coli stabilisiert FlaB1. Interessanterweise binden sowohl TP0658 als auch FliS (ein bekanntes aber nicht verwandtes Chaperon) an das gleiche Epitop in Flagellin, welches bei dessen Polymerisierung beteiligt ist. Meine Daten sprechen daher dafür dass TP658 und seine Verwandten “Assembly-Chaperone” der bakteriellen Flagelle sind.

Translation of abstract (English)

The study presented here is the first comprehensive attempt to identify protein-protein interactions (PPIs) of the bacterial flagellar apparatus on a genome-wide scale. We selected Treponema pallidum, the syphilis spirochete, as a model organism for flagellum interactome analysis because of its small genome (1,041 ORFs) which is available as a cloned ORFeome. Interestingly, the spirochete flagellum possesses unique features not found in other bacterial species such as a periplasmic localisation of two flagellum bundles fixed to the cell poles. The comprehensive genome-wide Y2H screens for all 75 T. pallidum flagellum and chemotaxis proteins against the whole genome prey array. In total 268 protein-protein interactions, involving 174 unique proteins were identified. To characterise the functional relevance of the proteins not previously known to be involved in motility but interacting with known flagellar proteins 23 orthologs were predicted in E. coli and another 30 in B. subtilis. These orthologs were tested for their functional involvement in motility using gene deletions of these orthologes protein. Motilty assays (swarming assays) were done for all 23 orthologous E. coli mutants and 7 Bacillus subtilis mutants. Five B. subtilis proteins (namely, yaaT, yhbE/YhbF, yllB, yloS and yviF) and 10 E. coli proteins (amiA, bcsC, rfaH, rpe, rpmJ, ycfH, yciM, yggH, yggW, and yncE) showed a motility phenotype, clearly supporting their functional relevance in bacterila motility. These included 8 uncharacterized proteins, for which I assigned a function in motility based on their motility defect in the orthologous gene mutant and their physical two-hybrid association with known flagellum proteins, namely, TP0046 (yaaT), TP0048 (yhbE/yhbF), TP0383 (yllB), TP0421 (yncE), TP0561 (ydjH), TP0658 (yviF), TP0712 (HP1034) and TP0979 (tatD). The Y2H interactions of TP0658/yviF, a protein of unknown function, with flagellins (FlaB1-3 in T. pallidum and FliC in E. coli), were biochemically verified. TP0658 binds in the C-terminal of FlaB1 comprising a peptide from L231 to D247 (the C loop of flagellin). This interactionn epitope is conserved in B. subtilis and other bacteria. One well conserved Asparagine residue of flagellins (Asn237 of FlaB1 and Asn255 of its B. subtilis homolog hag) is crucial for binding of yviF. A B. subtilis yviF mutant showed strongly reduced motility which was rescued by yviF overexpression and there are no detectable flagellins in the yviF mutant. Co-expression of TP0658 and FlaB1 in E. coli suggests that TP0658 stabilizes flagellin. Strikingly, both TP0658/yviF and fliS, a known but unrelated flagellin-specific chaperone, bind to the C-terminal part of flagellin which is implicated in polymerization of flagellins. Hence I suggest that TP0658 is another conserved assembly factor for flagellin proteins, potentially working in concert with FliS or replacing it in certain subsets of bacterial species.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Prof. Dr. Uwe Strähle, Dr. Peter Uetz
Date of thesis defense: 19. April 2006
Date Deposited: 28. Jun 2006 10:14
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Subjects: 570 Life sciences
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