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Untersuchungen in lebenden Zellen mit Hilfe neuer Methoden der Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie

Roth, Christian Michael

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PDF, German
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Abstract

Die Arbeiten von ERNST ABBE in der zweiten Hälfte des 19. Jahrhunderts brachten der Mikroskopie eine neue Leistungsfähigkeit und konnten so die Forschungs¬möglich¬keiten in der Biologie, vor allem in der Botanik, Zellbiologie und Mikrobiologie, und der Medizin deutlich verbessern. Im Jahr 1930 wurde die Fluoreszenzmikroskopie entwickelt und eröffnete völlig neue Möglichkeiten. Bis heute wurden zahlreiche Varianten der Fluoreszenzmikroskopie entwickelt. Hervorzuheben sind dabei die stimulierte Emissionslöschung (Abk.: STED), sowie die Einzelmolekül¬fluoreszenz¬spektroskopie (engl.: single molecule fluorescence spectroscopy, Abk.: SMFS), zu denen Methoden, wie Totalreflexions-Fluoreszenz Mikroskopie (engl.: total internal reflection fluorescence microscopy, Abk.: TRIFM) und die konfokale Einzelmolekül¬fluoreszenzmikroskopie gehören. Die Stärke der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie liegt in der geringen Konzentration der verwendeten, fluoreszenten Sonden. Der Einsatz solcher Sonden kann wiederum als Reporter für molekulare Interaktionen dienen, oder strukturelle Änderungen, z.B. in der Nanoumgebung, aufzeigen, die eine Heterogenität besitzen. Die Entwicklungen im Bereich der optischen Techniken, ermöglicht eine höhere Auflösung sogar unter die Auflösungsgrenze von ABBE (STED). Dies eröffnet den Biowissenschaften neue Einblicke in molekulare Prozesse in Zellen und leistet somit einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der komplexen Vorgänge in lebenden Organismen. Im Gegensatz zu Ensemble-Methoden, welche nur einen Mittelwert wiedergeben, kann man durch Betrachtung einzelner Moleküle Subpopulationen auflösen. Zu den Parametern, die der SMFS zugänglich sind, gehören die Fluoreszenzintensität, die Fluoreszenzlebensdauer, Orientierung des Dipols oder die Wellenlänge. Die Verwendung der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (engl.: fluorescence correlation spectroscopy, Abk.: FCS) ermöglicht eine Analyse der Dynamik innerhalb eines gewählten Zeitfensters. Dabei können Diffusions¬geschwindigkeit von Fluorophoren, aber auch photophysikalische Übergänge und der Konformation beobachtet werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Anwendung neuer Methoden der SMFS für Untersuchungen in lebenden Zellen, insbesondere von Transportprozessen. Daher setzt sich diese Arbeit im Wesentlichen mit zwei Schwerpunkten auseinander: (i) das gezielte Einschleusen fluoreszierender Sonden in lebenden Zellen, (ii) die Entwicklung einer Methode zur Beobachtung von schnellen Transport- und Diffusionsprozessen in lebenden Zellen. Die Verfügbarkeit endogen erzeugter Fluoreszenzfarbstoffe, also innerhalb der Zelle synthetisierter Farbstoff, ist begrenzt. Aufgrund der zusätzlichen geringen Photostabilität und komplizierter Photophysik, bedarf es hier alternativer Methoden. Organische Fluorophore, die entweder endogen oder exogen an den Protagonisten, z.B. ein Protein, gekoppelt werden, müssen die Zellmembran, entsprechend vor oder nach der Kopplung durchqueren. Dieser Transport wird durch die Zellmembran erschwert. Die Internalisierung solcher Stoffe kann z.B. durch Rezeptor vermittelten Transport oder Endozytose geschehen. Jedoch ist der Anspruch an den Transporter und seine Fracht in Bezug auf Größe und Form sehr hoch. Durch manuelle Methoden wie die Elektroporation oder Mikroinjektion werden die Zellen gestresst oder geschädigt und bieten nur bedingt eine Alternative mit Zukunft. Die Verwendung von zellmembrangängigen Proteinen ist in den vergangenen Jahren zu einer neuen Methode zur Aufnahme in Zellen gereift. Die Peptide sind für die pharmazeutische Industrie aufgrund der Zellmembrangängigkeit, die auch zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke ausgenutzt werden könnte und somit Arzneistoffe direkt in die entsprechenden Zellen transportiert, von großer Bedeutung. Zellmembrangängige Proteine, die in Viren oder auch in eukaryotischen Zellen vorkommen, gelangen durch die Zellmembran direkt in den Zellkern, um sich schließlich in den Nukleoli anzureichern. Bisherige Untersuchungen der viralen Proteine, wie z.B. das Tat-Protein des HI-Virus, haben gezeigt, dass die Aminosäuren Arginin und Lysin für den Erkennungs- und Aufnahmeprozess verantwortlich sind. Entsprechende Modifikationen des Tat-Proteins wurden teilweise sogar besser von den Zellen aufgenommen, als das Tat-Protein selber. Durch Verwendung von Homologen zu den nativen Aminosäuren besteht die Möglichkeit, die Peptide resistenter gegen einen möglichen Abbau durch Peptidasen zu machen. In Kooperation mit Prof Dr. D. SEEBACH, von der ETH-Zürich, wurden HeLa-Zellen mit Fluorescein markierten -Peptiden inkubiert. Die inkubierten -Peptide, basierend auf den -Aminosäuren, konnten mit Hilfe der Fluoreszenz des Farbstoffes mittels Fluoreszenz¬mikroskopie beobachtet und dokumentiert werden. Ebenso wie bei den -Peptiden konnte bei den -Peptiden das typische Anfärbungsmuster der Zellen ab einer Peptidlänge von acht Aminosäuren beobachtet werden. Das Dekamer wurde nahezu in allen Zellen vor allem in den Nukleoli gebunden. Die Aufnahmeeffizienz erfolgte nicht kontinuierlich über die Konzentration, sondern benötigte eine bestimmte Schwellenkonzentration, ab der der Internalisierungsprozess stattfindet. Durch die Experimente über das Aufnahmeverhalten der -Peptide in Zellen zeigten sich die Peptide als zuverlässige Transporter für molekulare Fracht durch die Zellmembran hindurch. Mit Hilfe dieses Transporters können neben Pharmazeutika, auch fluoreszente Sonden für die Diagnostik eingeschleust werden. Die Verwendung des Transporters für die Einschleusung fluoreszenter Sonden kann helfen, Signal- und Transportprozesse in der Zelle zu verfolgen. Durch Einschleusen einer Sonde und Aussetzen in der Nanoumgebung einer Zelle kann es, z.B. zur Verlangsamung durch Interaktionen, aber auch zu einer Erhöhung der Diffusion durch aktiven Transport kommen. Im Folgenden galt es eine Methode zu entwickeln, die derartige Unterscheide sichtbar machen. Die Kombination der konfokalen, zeitaufgelösten Einzelmolekül¬fluoreszenz¬mikroskopie (engl.: fluorescence lifetime imaging microscopy, Abk.: FLIM) mit der FCS ermöglicht die Verbindung der Vorteile zweier empfindlicher Methoden. Während FLIM mit einer hohen Empfindlichkeit Photonen einzelner Fluoreszenzfarbstoffe mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung detektieren kann, liefert die FCS Informationen über die Dynamik in dem beobachteten Bereich. Durch die Beobachtung mehrerer diffundierender Moleküle, z.B. in Lösung lassen sich, durch die aus der Fluoreszenz¬fluktuation erhaltene Korrelation, Aufschlüsse über die Dynamik, z.B. die Wechselwirkungen zwischen der Sonde und der Nanoumgebung, in dem beobachteten System geben. Die Verbindung der beiden Techniken erzeugt eine Diffusionskarte des beobachteten Systems, wie z.B. einer Zelle. Unterschiede in der Diffusionszeit können so Aufschlüsse über die fluoreszenten Reporter geben, die z.B. durch Interaktionen der fluoreszenzmarkierten Protagonisten mit zellulären Komponenten auftreten oder aufgrund erhöhter Viskositäten längere Diffusionszeiten erfahren. Auch aktiver Transport z.B. entlang von Microtubuli ließe sich von der normalen Zelldiffusion diskriminieren. Bisherige Arbeiten, welche diese Techniken verknüpften brachten das Scanning-FCS hervor. Durch schnelles mehrmaliges Abtasten eines Bereiches einer Probe konnten bisher lediglich langsamere Diffusionsprozesse von Membranproteinen beobachtet werden. In dieser Arbeit wird die Entwicklung der bildgebenden Diffusions¬mikroskopie gezeigt, die eine Kombination aus FLIM und FCS darstellt und auch schnellere Diffusionsprozesse bis in den Mikrosekundenbereich abbilden kann. Die Methode der bildgebenden Diffusionsmikroskopie wurde an verschiedenen Systemen getestet, um die Anwendbarkeit abzuschätzen. Die ersten Versuche Heterogenitäten in Lösungen zu erkennen wurden mit einer Spitze einer Mikrokapillare erreicht, die in eine Lösung mit einem Farbstoff markiertem Oligonukleotid eintauchte. Zwei Elektroden, eine davon in der Mikrokapillare als Anode, sorgten für eine gerichteten elektrophoretischen Fluss der Oligonukleotide zur Öffnung der Mikrokapillare und auch hinein. Beobachtet wurde ein Anstieg der Diffusionszeit innerhalb der Kapillaröffnung. Da die Moleküle entlang der optischen Achse wanderten, befanden sie sich, auf Grund der ellipsenartigen Asymmetrie des Laserfokus, länger im Beobachtungsvolumen und ergaben so länger Diffusionszeiten. Diese Experimente zeigten dass es möglich ist in der Diffusion räumlich aufgelöst darzustellen. Die Entwicklung der bildgebenden Diffusionsmikroskopie für zelluläre Systeme eröffnet die Möglichkeit Diffusionsprozesse über eine ganze Zelle hinweg zu beobachten. Zu diesem Zweck wurden wiederum fluoreszente Farbstoffe, als Sonden an ein dT20-Oligonukleotid gekoppelt, eingesetzt. Die Analyse der mittels der bildgebenden Diffusionsmikroskopie zeigte Heterogenitäten in der Diffusion. Prinzipiell wurde damit die Möglichkeit geschaffen die Einschleusung fluoreszenter Sonden, wie z.B. beta-Peptiden, zu untersuchen

Translation of abstract (English)

The work done by ERNST ABBE in the second half of the 19th century lead to new abilities in microscopy. His discoveries strongly enhanced research in biology, mainly in botany, cell biology and micro biology, and also in medicine. In 1930 fluorescence microscopy was developed and revealed new opportunities. Up to date a lot of methods in fluorescence microscopy have been developed. Novel approaches are stimulated emission depletion (abbr.: STED) and single molecule fluorescence spectroscopy (abbr.: SMFS), e.g. total internal reflection fluorescence microscopy (abbr.: TIRFM) and the confocal single molecule fluorescence microscopy. The power of single molecule fluorescence microscopy is the low concentration needed for the detection of fluorescent probes. Such probes can act as a reporter for molecular interactions, and reveal structural changes, e.g. in the nanoscale environment. Developments of optical techniques like STED of the techniques allow a higher resolution even below the resolution limit by ABBE. This leads to new insight in life science, exploring molecular processes in cells and contributes the understanding of complex procedures in life organisms. In contrast to ensemble methods, which only observe average values, one can reveal subpopulations by looking at single molecules. A lot of parameters can be obtained by SMFS, like fluorescence intensity, fluorescence lifetime and orientation of the absorption dipole or wavelength. The application of fluorescence correlation spectroscopy (abbr.: FCS) allows the analysis of dynamics within a certain time window. One can determine the velocity of diffusion of fluorophores, and also study photo physical processes or changes in the molecular scaffold. The goal of this work was the development and application of new methods in SMFS that allow the observation of transport processes in living cells. To this end this works deals with two main topics: (i) the concerted infiltration of fluorescent probes in living cells, (ii) the development of a new method for the observation of fast transport or diffusion processes in living cells. The availability of endogenous synthesized fluorescent dyes, which means synthesized inside the cell, is limited. As a result of the lower photo stability and complicated photo physics, there is a need for alternative methods. Organic fluorescent dyes, which are endogenously or exogenously, attached to a protagonist, e.g. a protein, have to transit the cell membrane at least once, before or after the coupling. This transport across the cell membrane can be complicated. The internalisation of such substances can be mediated by receptors or by endocytosis. However, the demand to the transport system and the cargo concerning size and shape are limited. Manual methods like electoporation or micro injection might stress or even damage the cells and are a future-limited option. The application of cell pentrating peptides (CPP) in recent years has grown to a new method in cellular uptake. For the pharmaceutical industry, the CPP are very interesting, because of their cell permeability, which can be used for crossing over the blood-brain-barrier. CPP, which can be found in viruses, but also in eukaryotic cells, can traverse the cell membrane and directly translocate in the cell nucleus to accumulate in the nucleoli. Previous studies of viral proteins, e.g. the Tat-protein derived from the HI-virus, revealed, that the amino acids arginine and lysine are a crucial part of the protein transduction domain (PTD) and the nuclear localisation sequence. Specific changes within the Tat-protein sequence shows the same or even better uptake into the cells, than the Tat-protein itself. By using a -homologous amino acid as a monomer one can achieve a peptide, which is more stable against proteolytic degradation. In cooperation with Prof. Dr. D. SEEBACH, from ETH Zurich, HeLa cells were treated with Fluorescein labelled -peptide. The -peptides, consisting of -amino acids, were observed by fluorescence microscopy. Similarly, -peptides were showing the same staining pattern than the native -peptides. Starting with a length of eight amino acids the cellular uptake was studied. The decamer was taken up by nearly all of the cells mainly localising in the nucleoli. The efficiency of the uptake was not continuous with increasing across the concentration. It was necessary to pass over a certain concentration, at which the uptake process was starting. With these studies of the behaviour of the cellular uptake of the -peptides it was shown that they can be used as reliable transporters of molecular cargo across the cell membrane. According to this it is possible to infilitrate pharmaceuticals, but also fluorescent probes for diagnostics. The infiltration of fluorescent probes by the peptides may help investigating the signalling or transport processes in cell, and could also be used to explore the nano environment inside the cells, where interactions have an influence on, e.g., the diffusion behaviour of the probe. Interactions are slowing down the diffusion of the probe, whereas an increase of the diffusion might be observed when the probe undergoes active transport. The following section describes the development of a method which could allow the visualization of suchlike phenomena. The combination of confocal fluorescence lifetime imaging (abbr.: FLIM) and FCS allows the connection of advantages of both techniques. Whereas, the collection of photons of single fluorophores with high sensitivity and high temporal and spatial resolution represents FLIM, FCS yields information about the dynamic of the observed volume. By monitoring many fluorophores, e.g. in solution, the correlation of the fluorescence fluctuation abandons interactions of the probe with its nano environment. The connection of both techniques generates a diffusion map of the observed area, e.g. a cell. Differences within the diffusion times contain information about the behaviour of the fluorescent probe, e.g. the protagonist can undergo interactions with cellular components or diffusion can be slowed down due to higher viscosities. The active transport, e.g. along microtubule, might be discriminated from regular cellular diffusion. Previous work applied regular confocal laser scanning for scanning FCS. The probe is scanned with high repetition rate and the correlation of subsequent pixels reveals only slow diffusion processes, e.g. membrane proteins. In this work the development of the diffusion imaging microscopy, a combination of FLIM and FCS, is presented, which allows to determine even faster diffusion processes down to the micro second time scale. The method of diffusion imaging microscopy (abbr.: DIM) was tested on different experimental systems to proof the feasibility. The heterogeneity of the diffusion has been observed at the tip of a micro capillary, dipped into a solution containing a fluorescent labelled oligonucleotide. The anode inside the micro capillary caused an electric field along which the oligonucleotides travelled. Within the capillary an apparently slower motion has been observed. Those experiments showed diffusion times can be used to give contrast in microscopic images. The development of the diffusion imaging microscopy on cellular systems gives the possibility to perform a diffusion analysis over a whole cell. To this end fluorophores linked to a dT20-oligonucleotide were brought into a cell and investigated by diffusion imaging microscopy. The resulting diffusion maps showed heterogeneities in cells. By development of this method the investigation of transport processes like uptake of -peptides, has become possible.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sauer, Prof. Markus
Date of thesis defense: 23 June 2006
Date Deposited: 19 Jul 2006 10:39
Date: 2006
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
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