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Structural Characterisation of the Mammalian SRP Receptor

Schlenker, Oliver

German Title: Strukturelle Charakterisierung des Säugetier-SRP-Rezeptors

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Abstract

In eukaryotes, secretory and membrane proteins are targeted to the endoplasmic reticulum (ER) membrane for cotranslational translocation. This requires the specific interaction of the signal recognition particle (SRP), a ribonucleoprotein, with its receptor (SR). The eukaryotic SR is a heterodimeric protein consisting of SRα and SRβ which is anchored to the ER membrane. In all three kingdoms of life the conserved GTPases in SRP and SR (in eukaryotes SRP54 and SRα, respectively) enable the formation of the docking complex in a GTP dependent manner. SRβ is the third and least understood GTPase participating in cotranslational targeting in eukaryotes. Therefore a more detailed view on the GTPase cycle of SRβ and functionally relevant SRβ effector interactions should be obtained. X-ray structure analysis was used to determine the structure of a soluble form of SRβ (SRβΔTM) in its GTP bound state in complex with a fragment of SRα. The structure allows to precisely define the minimal SRβ binding domain of SRα (SRX). The homology to other small GTPases and the underlying principles of regulation together with previous biochemical data allow to attribute a functional role to SRX in the activation of the SRβ GTPase. An immobilised peptide library was used in order to examine the interaction of SR with the translocon. Evidence is presented that the apo- and likely the GDP bound form of SRβΔTM (SRβΔTM-apo/GDP) bind to cytosolic loops of the translocon in contrast to SRβΔTM-GTP in complex with SRXHis or SRαHis. These experiments suggest that the SRX binding surface of SRβ-GTP, as observed in the SRXHis:βΔTMGTP X-ray structure, is the same as engaged in SRβΔTM-apo/GDP binding to the translocon. SRβΔTM-apo binds to peptides of several cytosolic loop regions of the translocon. Mapping of these regions on the available structure of the homologous translocon from Methanococcus jannaschii suggests that SRβΔTM-apo/GDP blocks the translocation pore. Based on the molecular structure of the SRXHis:βΔTM-GTP SRX belongs to the SNARE-like superfamily with the common fold of the longin domains (LDs). The common principles of the LD family are analysed by a comparison of surface hydropathicity and structure based sequence alignment with structurally known LDs. Putative LDs are considered according to secondary structure prediction and primary sequence alignment. The interaction of small GTPases with LDs is suggested to be important for the assembly of large complexes at or targeting of vesicles to the endomembrane system. Important structural information on the mammalian SRP:SR complex are still missing, including the arrangement of the individual protein subunits and the positioning of the SRP RNA. Extensive purification and assembly of a pentameric SRP:SR complex, consisting of SRα:βΔTM, SRP54, SRP19 and a 104 base pair long SRP RNA, was set up in order to establish the basis for further structural studies on this macromolecular complex.

Translation of abstract (German)

In eukaryotischen Zellen werden sekretorische und Membranproteine cotranslational zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) transportiert. Dies erfordert die Interaktion des Signalerkennungspartikels (Signal Recognition Particle, SRP), einem Ribonukleoprotein, mit seinem Rezeptor (SR). Der eukaryotische SR ist ein Heterodimer, der aus SRα und dem membranverankerten SRβ aufgebaut ist. In allen drei Königreichen des Lebens vermittelt die GTP-abhängige Wechselwirkung zwischen den in SR und SRP konservierten GTPasen die Bildung des Docking-Komplexes. SRβ ist die dritte, am wenigsten verstandene GTPase, die an der co-translationalen Translokation beteiligt ist. Der GTPase-Zyklus von SRβ wurde weiter aufgeklärt und funktionell relevante Schnittstellen zwischen SRβ und seinen Effektoren untersucht. Mit Hilfe von Röntgenstrukturanalyse wurde die Struktur einer löslichen Form von SRβ (SRβΔTM) im GTP-Zustand mit einem Fragment von SRα bestimmt. Mit Hilfe dieser Struktur wurde die minimale SRβ-Bindungsdomäne von SRα präzise definiert. Durch einen detailierten Vergleich mit den Strukturen von anderen kleinen GTPasen und deren Effektorkomplexen, sowie bekannten biochemischen Daten, konnte der SRX-Domäne eine funktionelle Rolle bei der Aktivierung der GTPase SRβ abgeleitet werden. Eine immobilisierte Peptidbibliothek wurde benutzt, um die Interaktion des Translokons mit dem SR zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass SRβΔTM in der Apo- und wahrscheinlich auch in der GDP-gebundenen Form (SRβΔTM-apo/GDP) an zytosolische Loopregionen des Translokons bindet, aber nicht in der GTP-Form im Komplex mit SRXHis oder SRαHis. Für die Bindung des Translokons wird von SRβ offenbar die selbe Oberfläche benutzt wie zur Bindung der SRX-Domäne. SRβΔTM-apo bindet an zahlreiche zytosolische Loopregionen des Translokons. Durch Veranschaulichung dieser Regionen anhand der Struktur des homologen Translokons von Methanococcus jannaschii kann vorschlagen werden, dass SRβΔTM-apo/GDP die Translokationspore blockiert. Basierend auf der Röntgenstruktur des SRXHis:βΔTM-GTP-Komplexes kann gezeigt werden, dass SRX zur Familie der SNARE-ähnlichen Proteine gehört mit dem allgemeinen Faltungsmuster der Longin-Domänen (LDs). Die grundsätzlichen Prinzipien der LD-Familie werden anhand von LDs mit bekannter Struktur analysiert, durch Vergleich der Oberflächenhydropathizität und der Prmärsequenz. Die Interaktion von kleinen GTPasen mit LDs ist daher wichtig für den Aufbau von grossen Komplexen oder Vesikeln an und den Transport von Vesikeln in Endomembran-Systeme. Wichtige molekulare Informationen über den Säugetier-SRP:SR-Komplex fehlen immer noch. Die aufwendige Aufreinigungsmethode und Rekonstitution eines pentameren SRP:SR-Komplexes bestehend aus SRα:βΔTM, SRP54, SRP19 und einer 104 Basenpaare langen SRP-RNA wurde etabliert, als Basis für weitere strukturelle Studien an diesem makromolekularen Komplex.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sinning, Prof. Dr. Irmgard
Date of thesis defense: 24 July 2006
Date Deposited: 27 Jul 2006 15:01
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Strukturanalyse, Signalerkennungspartikel
Uncontrolled Keywords: Röntgenstrukturanalyse , SRP Rezeptor , SEDL , SRP , LonginX-ray structural analysis , SRP receptor , SEDL , SRP , longin
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