Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

Clomeleon Biosensor-Mauslinien zur optophysiologischen Bestimmung der intrazellulären Chloridkonzentration in Nervenzellen

Schleich, Wolfram Bernhard

English Title: Clomeleon biosensor mouse lines for optophysiological determination of intracellular chloride concentration in neurons

[img]
Preview
PDF, German
Download (7Mb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

Chlorid hat eine weitreichende Bedeutung für die neuronale Signalverarbeitung. Seine intrazelluläre Konzentration entscheidet, ob GABA oder Glyzin eine erregende oder hemmende Wirkung auf Nervenzellen haben. Entgegen seiner physiologischen Bedeutung stehen nur wenige, mit Problemen in der Anwendung behaftete Techniken zur Verfügung, um intrazelluläre Chloridkonzentrationen messen zu können. Clomeleon ist ein ratiometrischer, genetisch kodierter Chloridindikator bestehend aus einer Fusion von cyan- und gelb-fluoreszierendem Protein, der nichtinvasive Chloridmessungen an lebendem Gewebe erlaubt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Strategien diesen Indikator in Biosensor-Mauslinien nutzbar zu machen und deren Anwendbarkeit anhand der Frage nach der Entwicklungsabhängigkeit der Chloridkonzentration von Neuronen zu testen. Es wurden sieben Linien transgener Mäuse generiert, die den Indikator unter Kontrolle des Thy1-Promotors exprimieren. Die Linien unterschieden sich in dem Expressionsmuster von Clomeleon. Generell wurde in diesen Linien eine weitverbreitete und hohe Expression des Indikators gefunden. Diese Mauslinien sind für Populations-Imaging gut geeignet. Einzelzell-Imaging ist durch die dichte Expression anspruchsvoll und verlangt nach einem quantitativen Ansatz, der unter definierten Messbedingungen die Ermittlung eines Hintergrundes erlaubt. Unter Beachtung dieser Einschränkung konnte an akuten Hirnschnitten dieser Linie der postulierte Abfall intrazellulärer Chloridkonzentrationen in Nervenzellen nach der Geburt gezeigt werden. Ausgehend von einer Konzentration von 21 mM bei P5 fällt die Chloridkonzentration bis auf 6 mM bei P20. Daraus folgt eine Umpolung der GABAergen Antwort bei P14. Darüberhinaus wurde eine universelle Clomeleon-Indikatormauslinie auf Basis des ubiquitär aktiven ROSA26-Promotors und einer loxP-flankierten Stopp-Kassette erzeugt. Durch Verpaarung mit einer Cre-Aktivatormauslinie erlaubt diese Linie die Expression des Indikators in genetisch definierten Zellpopulationen. Dieses Konzept birgt enorme Möglichkeiten zur Verbesserung der Imagingbedingungen. Einerseits stammt alles gesammelte Licht aus derselben genetisch identifizierten Zellpopulation, was die Aussagekraft von Populationssignalen erhöht. Andererseits besteht für das Einzelzell-Imaging die Chance vereinzelt stehende markierte Zellen zu erhalten, was die für quantitatives Imaging notwendige Hintergrundsbestimmung vereinfacht. Durch die niedrige Expression von Clomeleon in Nervengewebe sind intensitätsbasierte Imagingmethoden nur sehr eingeschränkt möglich, die Verwendung von 2P FLIM bietet jedoch eine sehr erfolgversprechende Möglichkeit, quantitative Messungen trotz der niederen Fluoreszenz durchführen zu können. Ein vergleichbares Konzept verfolgten wir durch Kombination von viralen Gentransfer und Techniken konditionaler Genaktivierung. Hier gelang es durch Infektion mit dem für Zellen völlig untoxischen rekombinanten AAV1/2-Virus in transgenen Aktivator-Mauslinien eine ausserordentlich hohe Expression von Clomeleon in genetisch definierten Nervenzellen zu erhalten. Diese Situation schafft ideale Voraussetzungen für das Imaging einzelner Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die chronische Expression von Clomelon in Biosensor-Mauslinien erfolgreich zur nichtinvasiven, optophysiologischen Darstellung der intrazellulären Chloridkonzentration eingesetzt werden können. Damit steht ein neues Werkzeug zur Verfügung, mit welchem viele, bisher experimentell nicht zugängliche biologische Fragestellungen nunmehr untersucht werden können.

Translation of abstract (English)

Chloride is of eminent relevance for neural signal processing. Its intracellular concentration determines whether GABA or glycine excite or inhibit neurons. Despite its physiological relevance only a few techniques are available to measure intracellular chloride concentrations. Clomeleon is a ratiometric genetically encoded indicator comprising a fusion of cyan and yellow fluorescent protein that allows noninvasive chloride measurements in living tissue. The work presented here deals with strategies to make this indicator available in biosensor mouse lines and to test their applicability by investigating the developmental dependence of chloride concentration in neurons. Seven mouse lines that express the indicator under control of Thy1 promotor have been generated. Each line exhibits a distinct expression pattern. Generally widespread and high expression of the indicator is observed. These lines are well suited for population imaging. Single-cell imaging is challenging due to the dense expression but became feasible by applying a quantitative approach that allowed for the determination of autofluorescence background by comparison with wildtype tissue. By considering these constraints the postulated decrease in intracellular chloride of neurons could be shown using acute slices. Starting from a concentration of 21 mM at p5 the concentration drops to 6 mM at p20 in CA1 neurons. That means an inversion of a GABAergic response around p14. Furthermore a universal chloride indicator mouse line was engineered making use of the ubiquitously active ROSA26 promotor and a loxP-flanked stop-cassette. This mouse line allows for expression of Clomeleon in a genetically defined cell population by a simple breeding scheme. This concept harbors enormous possibilities to improve imaging conditions. On the one side all collected light originates from the same genetically identified population augmenting the significance of population experiments. On the other side this concept increases the chance to obtain a sparse labeling facilitating background acquisition so vital for single-cell measurements. Due to the low expression levels in neural tissue, intensity based measurements are hardly feasible. The employment of 2P FLIM holds promise to conduct experiments despite low fluorescence. We pursued a similar labeling concept by combining virus-mediated gene transfer and techniques of conditional gene expression. We succeeded in achieving high levels of Clomelon expression in genetically defined neurons of an activator mouse line by infecting with the non-toxic AAV1/2 virus. This situation provides best conditions for single cell imaging. We showed that chronic expression of Clomelon in biosensor mouse lines enables successful non-invasive optophysiological recordings of intracellular chloride concentrations. This establishes a new tool for answering many questions that were experimentally inaccessible up to now.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. Peter H. Seeburg, Prof.
Date of thesis defense: 8 August 2006
Date Deposited: 08 Aug 2006 15:04
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Biosensor
Uncontrolled Keywords: Chlorid , Optophysiologie , viraler Gentransfer , Inhibition , Exzitationbiosensor , chloride , optophysiology , viral genetranfer , inhibition
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative