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Synthese modifizierter Oligonucleotid-Sonden für den DNA-Nachweis durch katalytische Signalamplifikation

Graf, Nora Julie Charlotte

English Title: Synthesis of Modified Oligonucleotide Probes for DNA Detection by Catalytic Signal Amplification

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PDF, German
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Abstract

Die Arbeit behandelt die Synthese Metallkomplex-funktionalisierter Oligonucleotide und Peptidnucleinsäuren (PNAs) und deren Anwendung als Sonden für den sequenzspezifischen DNA-Nachweis. Zum einen wurde dazu Metallkatalyse am DNA-Templat genutzt, zum anderen Signalverstärkung durch chemische oder enzymatische Katalyse. Eine Nucleinsäure kann als Templat funktionalisierte Oligonucleotide in räumliche Nähe zueinander bringen und deren intermolekulare Reaktion beschleunigen. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Redoxreaktion zwischen einer Metallkomplex- und einer Thiol-funktionalisierten Peptidnucleinsäure am DNA-Templat wurde fluorimetrisch verfolgt. Für die Nachweisreaktionen, die auf Signalverstärkung beruhen, wurden Konjugate von DNA-Oligonucleotiden mit Metallkomplexen synthetisiert, die bei Hybridisierung mit komplementärer DNA das Metallion (CuII, ZnII) freisetzen. Das CuII-Ion (bzw. ZnII-Ion) aktiviert als Cofaktor einen chemischen Präkatalysator (bzw. ein Apoenzym) und die anschließend durch den Katalysator (bzw. das Holoenzym) initiierten Reaktionen machen das DNA-Target durch Umsetzung fluoro- oder chromogener Substrate fluorimetrisch, photometrisch oder sogar für das Auge direkt sichtbar. Das DNA-Target konnte mithilfe dieser Signalwandlung (DNA - Metallion) mit hoher Empfindlichkeit und Sequenzspezifität nachgewiesen werden. Die verwendeten Metallkomplex-funktionalisierten Oligonucleotide wurden zum besseren Verständnis der Signalwandlung hinsichtlich ihrer thermodynamischen und kinetischen Stabilität charakterisiert. In einer Variante dieser Oligonucleotid-Konjugate wirkte das Metallion CuII als intramolekularer Fluoreszenzlöscher, sodass die Bindung einer komplementären Nucleinsäure in Form eines Fluoreszenzsignals verfolgt werden kann.

Translation of abstract (English)

The thesis covers the synthesis of metal complex functionalized oligonucleotides and peptide nucleic acids (PNA) and their application for DNA sequence detection, including both metal catalysis on DNA templates and signal cascades with chemical or enzymatic amplification. A nucleic acid template can trigger the intermolecular reaction of two functionalized, complementary oligonucleotides by promoting their spatial proximity. In the context of this work, a DNA-templated redox reaction between a metal complex and a thiol, both attached to oligo peptide nucleic acids, was followed fluorimetrically. As components of an artificial signal cascade, conjugates of DNA oligonucleotides with metal complexes were synthesized. These conjugates release the metal ion (CuII or ZnII) on hybridization with complementary DNA. The CuII ion (or ZnII ion) acts as a cofactor for a chemical precatalyst (or an apoenzyme) resulting in an active catalyst (or the holoenzyme). Subsequent reactions initiated by the catalyst give rise to the conversion of fluorogenic or chromogenic substrates. Thus, the signal can be monitored fluorimetrically or photometrically or is even visible to the naked eye. This methodology allows one to detect complementary DNA targets with high sensitivity and sequence specificity. For a better understanding of the underlying mechanisms, the metal complex functionalized oligonucleotides were characterized with respect to their thermodynamical and kinetical stability. Finally a fluorescent oligonucleotide conjugate was designed, with CuII acting as an intramolecular fluorescence quencher. This approach enables direct conversion of the hybridization event into a fluorescence signal.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Krämer, Roland
Date of thesis defense: 27. October 2006
Date Deposited: 07. Nov 2006 13:38
Date: 2006
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Inorganic Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: DNA-Nachweis , PNA , Fluoreszenz , Apoenzyme , SignalamplifikationDNA detection , PNA , fluorescence , apoenzymes , signal amplification
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