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Immortalisierung embryonaler Fibroblasten aus Wildtyp und Hupki (Human p53 knock-in) Mäusen durch Veränderungen des p19Arf/p53 Kontrollweges und Erst-Charakterisierung des neuen Prolin 72-kodierenden Hupki-Mausstamms

Belharazem, Djeda

English Title: Immortalization of embryonic Fibroblasts from Wildtyp and Hupki (Human p53 knock-in) mice through p19Arf/p53 pathway inactivation and First Characterisation of a new prolin 72-coding Hupki-mouse

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Abstract

Aufgrund zunehmenden Wissens um die Regulation des Wachstums maligner Zellen können neue Therapieansätze gefunden werden. Dafür ist es notwendig, mehr über die komplexen Mechanismen der Tumorentstehung und der unbegrenzten Proliferation, der Immortalisierung, von Zellen zu wissen. Immortale Zellen besitzen im Unterschied zu normalen Zellen kein begrenztes Teilungsvermögen, welches abhängig von der Anzahl der Zellteilungen und der Länge der Telomere (Harley et al., 1990) ist. Genauso unterscheiden sich Zelllinien von primären embryonalen (normalen) Zellen. Diese teilen sich bereits nach wenigen Passagen nicht mehr und treten in die Seneszenz ein, die mit charakteristischen morphologischen, zellphysiologischen, molekularen und biochemischen Veränderungen verbunden ist (Kanungo, 1994). Murine und humane Fibroblasten unterscheiden sich in den Mechanismen der Seneszenz: Der Hauptmechanismus der Seneszenz. Die 20%ige Sauerstoff Atmosphäre der Zellkulturbedingungen übt in den primären, embryonalen murinen Fibroblasten (MEFs) einen oxidativen Stress auf die Zellproliferation aus. P19/ARF-p53 scheint der wichtigste Regulationsmechanismus für die Seneszenz in diesen Zellen zu sein. Mit der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen wie z.B. p53 oder pRb durch Punktmutationen oder Deletionen kann die zelluläre Seneszenz unterbrochen und die Zelle zur Immortalisierung gebracht werden. Als Transkriptionsfaktor und Tumorsuppressor weist das p53- Gen Mutationen in 50% aller menschlichen Tumoren auf. Bekannt ist der p53- Polymorphismus im Codon 72 im Exon 4 in der Polyprolindomäne, das entweder für die Aminosäure Arginin (CGC) oder Prolin (CCC) kodiert. Beide Varianten zeigen biochemische Unterschiede im Zellzyklus, der Apoptose und der Tumorgenese-Regulation Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der spontanen Immortalisierungsrate der MEFs und der Hupki Maus Fibroblasten, die einen Teil des humanen Arginin p53- Gens vom Exon 4 zum Exon 9, HUFs R/R genannt, tragen (die HUFs wurden von der Humanen P53 knock in Maus (Hupki Maus) (Luo et al., 2001a) etabliert). Die MEFs weisen eine deutlich höhere Empfindlichkeit gegenüber der 20%igen Sauerstoffatmosphäre der Zellkulturbedingungen als die HUFs R/R auf. Nur ca. 10% (11 von 121) der gesamten primären Zellpopulationen überlebte die Seneszenz und traten in den Immortalisierungsprozess ein. Mehr als 60% der etablierten Zelllinien (7 von 11) weisen entweder p53 missense- Mutationen (5 von 7) vom Typ G>C oder C>G Transversion, mit einer Überexpression an p19 Protein, oder den p19/ARF- DNA Verlust (2 von7) auf. Dagegen verhielten sich die HUFs R/R, die in 90% der primären Zellklone zu immortalisierten Linien auswuchsen (109/120), deutlich resistenter gegenüber den angewandten reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygene species (ROS)) als die MEFs. Nur 20% der HUFs Zellklone (4 von 20) weisen eine Punkmutation oder eine Deletion in der p53-DNA-Bindungsdomäne auf. 80% der restlichen Zelllinien sind nicht dadurch betroffen Die durchflusszytometrische Analyse der Apoptose mittels Annexin/PI- Kit zeigt, dass die stressigen in vitro Zellkulturbedingungen mehr primäre MEFs in die Apoptose treiben als HUFs R/R. Nachdem die erste Hupki Maus mit dem p53 Arginin Protein ein recht gutes Model für in vivo und in vitro Untersuchungen des humanen p53 Gens darstellt, wurde eine zweite Hupki Maus mit der Prolin- Variante hergestellt, um die multiplen Fragestellungen nach dem p53 Polymorphismus zu beantworten. Die ersten im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten in vitro Studien zeigen in den Hupki Prolin (HUFs PP) Fibroblasten eine hohe Menge an p21 WAF in den klassischen in vitro Zellkulturbedingungen auf, die in den primären, embryonalen Hupki Arginin Fibroblasten. Erst nach Induktion mit gamma-Strahlen erreicht wurde. Dagegen weisen die HUF Zellen mit der p53 Arginin Variante eine Induktion der Perp (P53 apoptosis effactor related to PMP22) nach einer Gamma-Strahlen Exposition auf. Studien zeigten einen Zusammenhang zwischen dem heterozygoten Arg/Pro Genotyp und dem Lungenkarzinom (Fan et al., 2000). Auch das Prolin- Codon Pro/ Pro Genotyp weist eine Assoziierung mit Lungentumoren (Kawajiri et al., 1993) auf. Von 47, mit dem Prokarzinogenen Benzo(a)pyren B(a)P behandelten, primären, embryonalen heterozygoten Hupki Arginin/Prolin (HUFs RP) Zellpopulationen ließen sich 20 (42%) als Zelllinien etablieren: Davon weisen 25% der Zellklone eine p53 G>C, C>G oder C>T Punktmutation auf dem Prolin- Allel auf, gefolgt vom einem Verlust der Heterozygosität (LOH) des Arginin-Allels. Dieses Ergebnis scheint sich von der Immortalisierung der mit B(a)P behandelten Hupki hetereozygoten Arginin Fibroblasten (Liu et al., 2005) deutlich zu unterscheiden.

Translation of abstract (English)

Most mammalian cells do not divide indefinitely, owing to a process termed replicative senescence. In human cells, replicative senescence is caused by telomere shortening, but murine cells senesce despite having long stable telomeres. It has also been previously shown that mouse embryo fibroblasts (MEFs) respond to oxidative stress with 20% oxygen tension, typical of standard culture conditions, by undergoing cellular senescence. Senescence is generally defined as an irreversible state of G(1) cell cycle arrest in which cells are refractory to growth factor stimulation. In mouse embryonic fibroblasts, induction of senescence requires the presence of p19ARF and p53, as genetic ablation of either of these genes allows escape from senescence and leads to immortalization. Tumor suppressor proteins must be exquisitely regulated since they can induce cell death while preventing cancer. For example, the p19ARF tumor suppressor (p14ARF in humans) appears to stimulate the apoptotic function of the p53 tumor suppressor to prevent carcinogenesis induced by oncogene overexpression. Activation of growth arrest and apoptotic pathways by the p53 tumor suppressor (known as "Guardian of the Genome") pathway promotes the removal of tumorigenic cells, thus protecting against cancer in humans and mice. Most of the mutations that deactivate p53 in cancer usually occur in the DBD (DNA Binding Domain). The mutations destroy the ability of the protein to bind to its target DNA sequences, and thus prevents transcriptional activation of these genes. Several p53 gene polymorphisms have been described, one of this intragenic polymorphism leads to the expression of two different p53 proteins, with Arginine or Proline in codon 72 in a region that is rich in proline residues (Harris et al., 1986). This region is involved in the apoptotic activity of p53 and associated with several cancers susceptibilities. The generating of the human p53 arginin knock-in mouse strain (Luo et al., 2001) allowed new mammalian cell assays using gene targeting technology that select and score human p53 gene sequence mutations in human-p53 arginin knock-in (Hupki) murine embryonic fibroblasts (HUFs R/R) that have undergone immortalization. The subject of the current dissertation was the investigation of the spontaneous Immortalisation’s rate of MEFs and the HUFs R/R mouse fibroblasts: MEFs exhibit a clearly higher sensitivity to the 20%igen oxygen atmosphere of the cell culture conditions than HUFs R/R. Only 10% (11 of 121) of the entire primary cell populations survived the senescence and occurred in immortalisation. More than 60% of the established cell lines (7 of 11) exhibit either p53 mutations (5 of 7) of the type G to C or C to G Transversion, with a p19 protein overerexpression, or p19/ARF DNA deletion (2 von7). 90% HUFs R/R primary cell clones became immortalised celllines (109/120) after the Senescence, it seems that they behaved clearly more resistant to reactive oxygen species (reactive oxygene species (ROS)) than the MEFs. Only 20% HUFs R/R cell clones (4 of 20) exhibit a Punkmutation or a deletion in the p53-DNA-Binding domaine. 80% of the remaining cell lines were not concerned. The flowcytometry analysis of the Apoptose by annexin V/PI kit showed the high sensitivity of primary MEFs than HUFs R/R in in vitro cell culture conditions. The first Hupki mouse with the human p53 arginin variant (Luo et al., 2001) represents a quite good Model for in vivo and in vitro investigations of the human p53 gene, that why generating a second Hupki mouse strain in which a Prolin variant at codon 72 in exon 4 would be of considerable benefit to reseaech on cancer and p53 polymorphism. First in vitro studies accomplished with Hupki Prolin und Arginin mouse embryonic primary fibroblasts (HUFs P/P, HUFs R/R) showed a high expression of p21 WAF mRNA in the classical in vitro cell culture conditions in HUFs PP. However p21WAF mRNA seems induced in HUFsRR only in response to gamma-irradiation. It was also observed an induction of perp (p53 apoptosis effactor related to PMP22) in HUFs RR cells but not in HUFs PP. It is known that, p53 polymorphism is reportedly associated with lung cancer susceptibility However, not all investigations have been consistent (Fan et al., 2000). In the present study 47 Hupki arginin/prolin heterozygotes mouse embryonic primary fibroblasts cellpopulations (HUFs RP) were exposed to the tobacco smoke carcinogen benzo(a)pyren (BaP) to explore the association of which allel arginin or prolin in human lung tumors during in vitro immortalization of the primary cultures. 20 immortalised cell lines (42%) were established, 25% of them exhibit a p53 G to C, C to G or C to T point mutation on the prolin allele followed of loss the heterozygosity (LOH) of the arginin allele. The achieved result is clearly different from the Hupki arginin homozygotes fibroblasts immortalisation assay from Luo et al., 2005.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dr. rer. nat. Lutz Gissmann, Prof.
Date of thesis defense: 24. October 2006
Date Deposited: 07. Dec 2006 10:59
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Immortalisierung , Primäre Fibroblasten , Knock in Maus , Tumorgenese , MationenHupki Fibroblasten , Arginin , Prolin P53 , immortalization , p53/p19ARF pathway
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