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Strahleninduzierte Genexpression von Zellzykluskontroll- und DNA-Reparaturgenen als Biomarker für individuelle Strahlenempfindlichkeit

Wiebalk, Katrin

English Title: Radiation-induced gene expression of cell cycle control and DNA repair genes as biomarker for individual sensitivity to ionizing radiation

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PDF, German
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Abstract

Zielsetzung: Ein großes Problem der Strahlentherapie ist das Auftreten von schweren Nebenwirkungen. Die Reaktion auf die Bestrahlung ist individuell sehr unter¬schiedlich und kann bislang mit her¬kömm¬lichen in vitro Methoden nicht verlässlich vorausgesagt werden. Die Untersuchung der Induzier¬barkeit von Zellzykluskontroll- und DNA-Reparaturgenen nach Bestrahlung von Lymphozyten in vitro soll mögliche Biomarker zur Be¬stim¬mung der individuellen klinischen Strahlenempfindlichkeit aufdecken. Mithilfe dieser Marker könnte in Zukunft ein klinisch nutzbarer Test entwickelt werden. Methoden: Die Induzierbarkeit der Genexpression von Zellzykluskontroll- und DNA-Reparaturgenen nach γ Bestrah¬lung von Lympho¬zyten in vitro wurde mittels quantitativer Realtime-PCR bestimmt. Zu¬nächst wur¬den die ex¬peri¬men¬tellen Bedingungen an Lymphozyten von gesunden Blutspendern optimiert. 99 Prostata¬krebs¬patien¬ten wurden vor der Strahlentherapie rekrutiert und an ihren Lympho¬zyten wurde die Induzier¬barkeit von CDKN1A (p21, Cip1, WAF1), PCNA, TP53, XPC, GADD45A und DDB2 4h nach Bestrah¬lung in vitro bestimmt. Die erhaltenen Induktionswerte wurden mit dem Ausmaß der Neben¬wir¬kun¬gen ver¬glichen, die die Patienten während ihrer Bestrahlung tatsächlich entwickelten. Zum besseren Verständnis der im ersten Teil bestimmten Unterschiede in der Induktion wurde im Zell¬mo¬dell an p21-kompetenten und p21-defizienten Zellen untersucht, ob das Fehlen von CDKN1A (p21, Cip1, WAF1) eine Aus¬wirkung auf die zelluläre Strahlenempfindlichkeit hat. Desweiteren wurde die Tech¬nik der RNA-Inter¬ferenz angewendet, um die Expression des Gens CDKN1A zu vermindern. Die Aus¬wirkungen auf die Expression anderer DNA-Reparaturgene wurden mit Hilfe der quantitativen Real¬time-PCR bestimmt. Ergebnisse: Bei den sechs untersuchten Genen konnte die Induktion von XPC als möglicher Biomarker für individuelle klinische Strahlenempfindlichkeit identifiziert werden. Da Rauchen einen starken Effekt auf die XPC-Induktion hatte (p<0,01), wurde ein logistisches Regressionsmodell ver¬wendet, um so die Asso¬zia¬tion der XPC-Induktion und der Strahlenempfindlichkeit für Tabakkonsum zu adjustieren. Nach dem Ad¬jus¬tieren ergab sich ein statistisch sig¬nifikant erhöhtes Risiko für klinische Strahlenempfind¬lich¬keit in den Patienten mit hohen XPC-Induktionsfaktoren (Odds-Ratio: 5,3; p = 0,03; Konfidenzintervall: 1,25-24,5). Im Zellmodell zeigten sich keine Unterschiede nach Bestrahlung im Wachstums¬verhalten und im DNA-Re¬paratur¬test (Comet Assay) in p21-kompetenten und p21-defizienten Zellen. Es konnte jedoch ein deut¬licher Unterschied in der Verteilung auf die Zellzyklusphasen beobachtet werden. p21-defiziente Zellen wur¬den nach Bestrahlung im Gegensatz zu der parenteralen Zelllinie nicht in der G1-Phase des Zellzyklus an¬ge¬halten. Die Experimente mit p21-siRNA zeigten, dass nach Reduktion der CDKN1A-Trans¬kript¬men¬ge eine Erhöhung der Mengen von PCNA und GADD45A eintritt. Auch bei verminderter CDKN1A-Men¬ge blieb die Induzierbarkeit von CDKN1A nach Bestrahlung erhalten. Schlussfolgerungen: Das Induktionsverhalten von XPC nach Bestrahlung in vitro könnte sich möglicher¬weise als prädiktiver Marker für klinische Strahlenempfindlichkeit eignen. Allerdings ist zu beachten, dass das Rauchverhalten der untersuchten Patienten einen starken Einfluss auf die Induktion von XPC hat¬te, was eine Adjustierung nötig machte. Für die Entwicklung eines aussagekräftigen Tests werden weit¬ere Untersuchungen an größeren Patientengruppen nötig sein sowie komplexere Auswertungen mit ver¬schiedenen Markern wie auch der konstitutiven RNA-Expression, Polymorphismen in DNA-Repa¬ra¬tur¬genen, Antioxidantienspiegel im Plasma und weiteren Faktoren. Die Methode der RNA-Interferenz eig¬net sich, um zelluläre RNA-Mengen zeitweise zu reduzieren und so weiter¬führende mechanistische Unter¬suchungen durchzuführen.

Translation of abstract (English)

Aim: Radiotherapy is limited by occurrence of severe side effects. Inter-individual variation in sensitivity of normal tissue to IR in cancer patients can be high and can not be reliably predicted prior therapy. To identify possible biomarkers for clinical hypersensitivity to radiation, inducibility of cell cycle control DNA-repair genes after irradiation of lymphocytes in vitro was measured. Based on these markers, a clinical assay for hypersensitivity to radiation could be developed. Methods: Inducibility of gene expression of cell cycle control and DNA-repair genes after γ irradiation of lymphocytes in vitro was analyzed using quantitative real-time PCR. Firstly, experimental conditions were optimized with lymphocytes from healthy blood donors. Then, 99 prostate cancer patients were recruited prior to radiotherapy and in their lymphocytes, inducibility of CDKN1A (p21, Cip1, WAF1), PCNA, TP53, XPC, GADD45A and DDB2 4h was measured after irradiation in vitro. Induction factors were compared with the incidence of side effects which patients developed during therapy. For a better understanding of the differences in gene induction, a cell culture model with p21-proficient and p21-deficient cells was used to determine the effect of loss of CDKN1A (p21, Cip1, WAF1) on cellular radiosensitivity. In addition, RNA interference was used to reduce expression of CDKN1A gene. The effect on expression of other DNA-repair genes was determined with quantitative real-time PCR. Results: Out of the six genes investigated, induction of XPC could be identified as a possible biomarker for predicting clinical hypersensitivity to radiation. As tobacco consumption was shown to affect XPC induction strongly, a logistic regression model was used to adjust the association of XPC induction and hypersensitivity for tobacco consumption. After adjustment for smoking, individuals with highest XPC inducibility showed an increased risk to suffer from adverse reactions during radiotherapy (Odds-Ratio: 5,3; p = 0,03; confidence limits: 1,25-24,5). In the cell culture model, no differences between p21-proficient and p21-deficient cells were found with regard to cell growth and DNA repair (Comet Assay) after irradiation. However, a pronounced difference in distribution into the different phases of cell cycle could be observed. p21-deficient cells showed no stop in G1-phase while p21-proficient did. The experiments with p21-siRNA showed a reduction of CDKN1A mRNA and an increase of PCNA and GADD45A mRNA amounts. Inducibility of CDKN1A after irradiation could be measured although the CDKN1A mRNA amount was reduced by siRNA. Conclusion: XPC induction after irradiaton in vitro may serve as a predictive marker for clinical hypersensitivity to radiation. Smoking habits of the analyzed patients have however a strong effect on XPC induction thus requiring adjustment for tobacco consumption. Further mechanistic analyses as well as molecular-epidemiological studies are necessary to establish XPC mRNA induction in vitro as a biomarker for hypersensitivity to radiation. Possible factors for a more complex analysis are constitutive RNA expression, polymorphisms in DNA-repair genes, antioxidant levels in plasma and others. RNA interference is a suitable method to reduce RNA levels for a certain time which allows further mechanistic analyses.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Popanda, Priv.-Doz Odilia
Date of thesis defense: 13 December 2006
Date Deposited: 08 Jan 2007 13:50
Date: 2006
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Strahlenempfindlichkeit , DNA-Reparatur , Zellzykluskontrolle , Genexpression , Biomarkerradiosensitivity , DNA repair , cell cycle control , gene expression , biomarker
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