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Molecular Analysis of the Unconventional Export Machinery of HASPB, a component of the surface coat of Leishmania parasites

Stegmayer, Carolin

German Title: Molekulare Analyse der unkonventionellen Exportmaschinerie von HASPB, eines Zelloberflächenproteins von Leishmania Parasiten

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Abstract

Summary Leishmania HASPB is a lipoprotein that is exported to the extracellular space from both Leishmania parasites and mammalian cells via an unconventional secretory pathway (Denny et al., 2000; Stegmayer et al., 2005). Exported HASPB remains anchored in the outer leaflet of the plasma membrane mediated by myristate and palmitate residues covalently attached to the N-terminal SH4 domain of HASPB (Denny et al., 2000; Stegmayer et al., 2005). HASPB targeting to the plasma membrane depends on SH4 acylation, which occurs at intracellular membranes. How acylated HASPB is targeted to the plasma membrane and, in particular the subcellular site of HASPB membrane translocation is unknown. Furthermore, possible secretory mechanisms for HASPB are not yet clarified in molecular terms. In order to address this issue, a screening for clonal CHO mutants derived from somatic mutagenesis that are incapable of exporting HASPB, was performed. In such a CHO mutant cell line HASPB was myristoylated and palmitoylated and was mainly localized to the plasma membrane as judged by confocal microscopy and subcellular fractionation. However, based on a quantitative flow cytometry assay and a biochemical biotinylation assay of surface proteins, HASPB transport to the outer leaflet of the plasma membrane was largely reduced in this mutant despite a normal expression level of the HASPB reporter molecule compared to CHO wild-type cells. These findings indicate that the subcellular site of HASPB membrane translocation is the plasma membrane as the reporter molecule accumulates in this location when export is blocked. Hence, based on these results a two-step process of HASPB cell surface biogenesis can be defined, in which SH4 acylation of HASPB mediates intracellular targeting to the plasma membrane. In a second step, the plasma membrane-resident machinery that is apparently disrupted in the CHO mutant cell line, mediates membrane translocation of HASPB. Intriguingly, the angiogenic growth factor FGF-2 and Galectin-1, a lectin of the extracellular matrix, proteins secreted by unconventional means, were shown to be secreted normally from the HASPB export mutant cell line. These observations demonstrate that the export machinery component defective in the export mutant cell line functions specifically in the HASPB export pathway. However, as revealed from the mutagenesis analysis the identified chemokine orphan receptor 1 was not the reason for the perturbed HASPB membrane localization in CHO K3 cells since its expression did not seem to be affected in CHO K3 cells. In the second chapter of this thesis, the SH4 protein HASPB, besides being localized to the cell surface, was found to be associated with extracellular vesicles. HASPB induces curvature of the plasma membrane resulting in the formation of highly-dynamic non-apoptotic plasma membrane blebs (Tournaviti et al., 2006 submitted). Based on these observations cell culture supernatants from HASPB expressing CHO cells were analyzed. As revealed by flotation analysis the detected sedimentable material contained a vesicle-associated HASPB population. Importantly, other SH4 proteins such as Src, Fyn, Yes and Lck were not detectable in extracellular vesicles. Since these proteins were able to induce the formation of plasma membrane blebs, the extracellular HASPB vesicle population was shown not to be a consequence of plasma membrane blebbing, a process promoting the shedding of plasma membrane-derived vesicles that are released into the extracellular space. This observation was confirmed by results obtained from HeLa cells that were able to produce HASPB-containing vesicles. Importantly, the formation of plasma membrane blebs was largely reduced in this cell line. As judged by protease protection experiments HASPB was shown to be located on the inner leaflet of the vesicle membrane. Colocalization analysis with different exosomes markers further confirmed that HASPB might be exported via vesicles being released by the MVB sorting machinery. Furthermore employing linear sucrose gradients and electron microscopy, these vesicles corresponded to the reported density of 1.15 g/ml for exosomes (Heijnen et al., 1999) as well as to the exosomal size with diameters <100 nm (Stoorvogel et al., 2002). Together, these findings strongly suggest that dually acylated HASPB localized on the inner leaflet of the plasma membrane is delivered into vesicles that are released by the MVB sorting machinery into the extracellular space.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Leishmania HASPB ist ein Lipoprotein, das unconventionell sowohl von Leishmania Parasiten als auch von Säugetierzellen exportiert wird (Denny et al., 2000; Stegmayer et al., 2005). Exportiertes HASPB bleibt aufgrund einer Myristoylierung und einer Palmitoylierung in der N-terminalen SH4 Domäne auf der extrazellulären Oberfläche der Plasmamembran verankert (Denny et al., 2000; Stegmayer et al., 2005). Diese SH4-spezifische Acylierung erfolgt an intrazellulären Membranen und ist die Voraussetzung für den Transport von HASPB zur Plasmamembran. Zum heutigen Standpunkt jedoch ist der Exportweg von HASPB noch ungeklärt, im speziellen der subzelluläre Ort der HASPB Membrantranslokation. Zudem sind mögliche molekulare Ma¬schinerien für den Export von HASPB noch nicht bekannt. Aus diesem Grund wurden mittels somatischer Mutagenese klonale CHO Mutanten generiert, die sich durch einen Defekt im HASPB Export auszeichneten. HASPB war in einer solchen Mutante (CHO K3) sowohl myristoyliert als auch palmitoyliert und konnte assoziiert mit der Plasmamembran nachgewiesen werden, wie konfokale Mikroskopie und subzellulare Fraktionierung gezeigt haben. Im Gegensatz dazu war der Transport von HASPB an die extrazelluläre Oberfläche der Plasmamembran, trotz eines mit dem Wildtyp überein¬stimmenden Expressionslevels, in CHO K3 Zellen stark reduziert. Dies wurde sowohl mittels Durchflusszytometrie als auch biochemischer Zelloberflächen¬biotinylierung nachgewiesen. Daraus resultierend scheint die Plasmamem¬bran der subzelluläre Ort der HASPB Membrantranslokation zu sein. Dies wird durch die Akkumulation des Fusionsproteins an dieser Stelle im Falle eines Exportdefekts bestätigt. Anhand dieser Daten kann ein Exportmodell aufgestellt werden, in dem, im ersten Schritt, die SH4 Acylierung den intra¬zellulären Transport von HASPB an die Plasmamembran vermittelt. Dort wird dann im zweiten Schritt die Translokation von HASPB über eine Plasma¬membran-lokalisierte Maschinerie, welche in CHO K3 Zellen defekt zu sein scheint, ermöglicht. Interessanterweise werden FGF-2 und Galectin-1, beides unkonventionell sezernierte Proteine, in CHO K3 Zellen an die Oberfläche der Plasmamembran transloziert. Dies beweist, dass die entsprechende Kom¬ponente, die in der Exportmaschinerie von CHO K3 Zellen defekt ist, eine wichtige Funktion spezifisch im Export von HASPB einnimmt. Der in CHO K3 Zellen identifizierte Chemokine Orphan Rezeptor 1 konnte als Ursache für den HASPB Exportdefekt dieser Zellen ausgeschlossen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das SH4 Protein HASPB, neben seiner Lokalisation an der Zelloberfläche, zudem noch mit extrazellulären Vesikeln assoziiert ist. An der Plasmamembran lokalisiertes HASPB führt zur Bildung von dynamischen nicht-apoptotischen Aus¬stülpungen (Tournaviti et al., 2006 submitted). Aus diesem Grund wurde der Zellkulturüberstand von HASPB-exprimierenden Zellen auf sedimentierbares Material mittels Ultrazentrifugation untersucht. Darin konnte in Nycodenz Flotationsgradienten eine HASPB-assoziierte Vesikelfraktion nachgewiesen werden. Interessanterweise konnten andere SH4 Proteine wie Src, Fyn, Yes and Lck nicht in extrazellulären Vesikeln gefunden werden. Aufgrund der Tatsache, dass diese Ausstülpungen der Plasmamembran in diesen Zelllinien beobachtet werden konnten, kann angenommen werden, dass die extra¬zellulären HASPB-assoziierten Vesikel nicht durch das Abschnüren dieser verursacht wurden. Bestätigt wird diese Beobachtung durch die Analyse von HeLa Zellen, bei denen HASPB-assoziierte Vesikel nachweisbar waren, jedoch Ausstülpungen der Plasmamembran nur in gerigem Maße beobachtet wurden. Wie mit Proteaseschutz-Experimenten bewiesen werden konnte, ist HASPB im Lumen dieser extrazellulären Vesikel lokalisiert. Kolokalisations¬experimente mit verschiedenen Exosomenmarkern bestätigte des weiteren, das HASPB, vermittelt durch die MVB Maschinerie, in Vesikeln exportiert wird. Diese Aussage konnte mit den Ergebnissen von linearen Sucrose¬gradienten und mittels Elektronenmikroskopie noch bekräftigt werden. HASPB-assoziierte Vesikel liegen mit einer Dichte von 1,15 g/ml (Heijnen et al., 1999) im Dichtebereich von Exosomen und besitzen, ebenso wie Exosomen, einen Durchmesser von weniger als 100 nm (Stoorvogel et al., 2002). Zusammenfassend kann ein zweites Exportmodell aufgestellt werden, in dem vollständig acyliertes HASPB, welches an der cyto¬plas¬mati¬schen Seite der Plasmamembran lokalisiert ist, Zutritt zur MVB Maschinerie gewährt wird und schließlich in Vesikeln exportiert wird.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nickel, Prof. Dr. Walter
Date of thesis defense: 15 December 2006
Date Deposited: 09 Feb 2007 09:10
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Heidelberg University Biochemistry Center
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Sekretion
Uncontrolled Keywords: HASPBHASPB
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