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Regulation of lipid signaling at the Golgi by the lipid phosphatases hSAC1 and OCRL1

Cheong, Fei Ying

German Title: Die Regulation von lipid signaling am Golgi Apparat durch die Lipidphosphatasen hSAC1 und OCRL1

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Abstract

Phosphoinositides are key lipid signaling molecules present in membranes of all eukaryotes. Different species of phosphoinositides serve as membrane signposts at distinct cellular compartments. This assymetric distribution of phosphoinositides is achieved by the presence of an elaborate set of lipid kinases and phosphatases operating at specific organelle membranes. The lipid phosphatase SAC1 is found in both endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. Similar to yeast Sac1p, human SAC1 (hSAC1) is the major phosphatidylinositol-4-phosphatase (PI(4)P-phosphatase). Distinct localization of hSAC1 in both ER and Golgi membranes suggests that this PI(4)P-phosphatase has compartment specific roles in regulating steady state distribution of PI(4)P in these organelles. OCRL1 is a Golgi and endosomal localized PI(4,5)P2 5-phosphatase that is implicated in a severe X-linked disease, Lowe syndrome, which is characterized by congenital cataracts, Fanconi syndrome and mental retardation. How mutations in OCRL1 cause Lowe syndrome is unknown. The functional analysis of hSAC1 and OCRL1 in regulating Golgi PI(4)P and PI(4,5)P2 is the main focus of this work. Confocal immunofluorescence and immuno-electron microscopy (immuno-EM) show that PI(4)P and hSAC1 form an opposing gradient in the Golgi. hSAC1 is highly enriched at Golgi cisternal membranes while PI(4)P is concentrated at the trans-Golgi network (TGN) where cargo proteins are packaged and exported. Golgi enzymes such as N-acetylglucosaminyltransferase I (NacT1) and mannosidase II (ManII) are preferentially found in these PI(4)P-depleted areas. siRNA-mediated knock-down of hSAC1 leads to accumulation of PI(4)P at Golgi, plasma membrane and endosomal like structures and causes mislocalization of ManII and NacT1. This data suggests that SAC1 establishes PI(4)P-depleted Golgi regions that are important for proper localization and recycling of Golgi resident enzymes. Conversely, depletion of OCRL1 does not disturb Golgi morphology or induce mislocalization of Golgi resident enzymes. However, bulk secretion is inhibited in OCRL1 depleted cells. The OCRL1-b splice variant populates TGN and early endosomal compartment whereas the OCRL1-a splice variant containing an extra 8 amino acid acidic cluster is found only in a subset of late endosomal/ lysosomal membranes. This distinct localization of OCRL1 splice variants indicates that each isoform might regulate different trafficking routes by regulating PI(4,5)P2 levels at these compartments. Together, the results show that hSAC1 and OCRL1 establish distinct phosphoinositide-specific domains within the Golgi that are instrumental for segregation of anterograde trafficking from the recycling of resident Golgi enzymes.

Translation of abstract (German)

Phosphoinositide sind Lipidsignale mit Schlüsselfunktion, die in den Membranen aller Eukaryoten vorkommen. Die verschiedenen Klassen von Phosphoinositiden dienen als spezifische Wegweiser an den Membranen zellulärer Kompartimente. Die asymmetrische Verteilung der Phosphoinositide wird durch ein komplexes Netzwerk von Lipidkinasen und –phosphatasen gewährleistet, die jeweils spezifisch an den Organellmembranen arbeiten. Die Lipidphosphatase Sac1 befindet sich sowohl im Endoplasmatischen Retikulum (ER) als auch im Golgi-Apparat. Konserviert von der Hefe zum Mensch, ist Sac1 die wichtigste Phosphatidylinositol 4-Phosphatase (PI(4)P-Phosphatase). Die Lokalisation von hSAC1 an ER- und Golgimembranen legt nahe, dass dieses Enzym kompartimentspezifische Rollen in der Regulierung der Verteilung von PI(4)P in diesen Organellen hat. OCRL1 ist eine PI(4,5)P2 5-Phosphatase am Golgi und in Endosomen. Mutationen in OCRL1 verursachen das Lowe Syndrom, eine schwere X-chromosomal vererbte Krankheit. Das Lowe-Syndrom zeichnet sich durch congenitale Katarakte, schwere Nierenschäden und geistige Behinderung aus. Wie Mutationen in OCRL1 das Lowe-Syndrom verursachen, ist unbekannt. Die funktionelle Analyse der Regulierung von PI(4)P und PI(4,5)P2 am Golgi durch hSAC1 und OCRL1 ist das Thema dieser Arbeit. Konfocale Immunfluoreszenz und Immuno-Elektronenmikroskopie zeigen, dass PI(4)P und hSAC1 entgegengesetze Gradienten im Golgi bilden. hSAC1 ist in den Membranen der Golgizisternen angereichert, während PI(4)P im Trans-Golgi-Netzwerk (TGN konzentriert ist. Im TGN werden sekretorische Proteine auf dem Transportweg verpackt und exportiert, Golgienzyme wie N-Acetylglucosaminyltransferase I (NacT1) und Mannosidase II (ManII) befinden sich bevorzugt in Golgiregionen mit geringem PI(4)P Gehalt. Depletierung von hSAC1 mittels siRNA führte zur Akkumulierung von PI(4)P im Golgi, an der Plasmamembran und in endosmalen Strukturen und führte zur Mislokalisierung von ManII und NacT1. Dieses Ergebnis legt nahe, dass SAC1 am Golgi Regionen mit geringem PI(4)P-Gehalt herstellt, welche für die korrekte Lokalisation und das Recycling Golgi-residenter Enzyme wichtig sind. Depletierung von OCRL1 mittels RNAi verändert jedoch weder die Morphologie des Golgi, noch führt sie zur Mislokalisation Golgi-residenter Enzyme. Allerdings hemmt die Entfernung von OCRL1 die zelluläre Proteinsekretion. OCRL1 kommt in zwei Spleissvarianten vor: OCRL1-a und OCRL1-b. Die OCRL1-b Variante kommt im TGN und in frühen Endosomen vor, wohingegen die Variante OCRL1-a, welche zusätzlich ein Sequenzmotif aus 8 hauptsächlich sauren Aminosäuren enthält, nur in einer bestimmten Population von späten Endosomen/ Lysosomen vor. Die spezifische Lokalisation von OCRL1 könnte bedeuten, dass die Isoformen jeweils spezifische Transportwege regulieren, indem sie die PI(4,5)P2 Level in ihren Kompartimenten anpassen. Zusammengenommen zeigen diese Resultate, dass hSAC1 und OCRL1 spezifische Phosphosinositiddomänen im Golgi herstellen, die für die Trennung von Recycling von Golgi-residenten Proteinen und anterogradem Transport von sekretorischen Proteinen unerlässlich sind.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayinger, Dr. Peter PD
Date of thesis defense: 19. January 2007
Date Deposited: 26. Jan 2007 13:05
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Cytologie, Biochemie, Inositolpolyphosphat-Phosphatase <Inositolpolyphosphat 5-Phosphatase>, Phosphatidatphosphatase, Phospholipase D, Golgi-Appa
Uncontrolled Keywords: hSAC1 , OCRL1 , Phosphoinositide , Membrantransport , LipidphosphatasenhSAC1 , OCRL1 , Phosphoinositides , membrane trafficking , lipid phosphatases
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