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Untersuchungen zum differentiellen Transport der alpha1- und alpha2-Untereinheiten des GABA-A-Rezeptors und zur TNT-vermittelten interzellulären Kommunikation zwischen Astrozyten und Neuronen

Schlicker, Oliver

English Title: Analysis of the differential transport of the GABA-A-Receptor-alpha1- and alpha2-Subunits and of the TNT-dependent, intercellular communication between Astrocytes and Neurones

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Abstract

GABAA-Rezeptoren sind pentamere Neurotransmitterrezeptoren, die in ihrer Untereinheitenzusammensetzung stark variieren können. Verschiedene Rezeptor-Subtypen zeigen dabei eine differentielle Verteilung an der somato-dendritischen Membran hippokampaler Neurone. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der differentielle Transport der Untereinheiten alpha1 und alpha2 des GABAA-Rezeptors in hippokampalen Neuronen untersucht. Hierzu wurden die Untereinheiten entweder C- oder N-terminal mit GFP-Varianten mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften markiert, um eine simultane mikroskopische Untersuchung in vivo zu ermöglichen. Mit Hilfe sensitiver Oberflächenimmunfluoreszenzfärbungen sowie über die GFP-Fluoreszenz der Fusionsproteine konnten die Rezeptorchimären sowohl in kultivierten Zelllinien, als auch in hippokampalen Neuronen an der Plasmamembran detektiert werden - ein Hinweis auf ihren effizienten Transport. Mittels Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation konnte zudem gezeigt werden, dass die Fusionsproteine in Gegenwart der Untereinheiten beta2 und gamma2 zu pentameren Rezeptoren oligomerisieren können. Elektrophysiologische Analysen der Rezeptorchimären zeigten, dass diese funktionelle, GABA-sensitive Chlorid-Kanäle ausbilden können. Die als funktionell charakterisierten Fusionsproteine wurden anschließend für mikroskopische in vivo Transportstudien in kultivierten, hippokampalen Neuronen verwendet. Diese Studien zeigten, dass alpha1- und alpha2-Rezeptorchimären an unterschiedlichen Bereichen der Plasmamembran „Cluster“ bilden. Während die „Cluster“ von alpha1-Rezeptor-Subtypen homogen verteilt, sowohl am Zellsoma, als auch an den Dendriten detektiert werden konnten, waren die „Cluster“ von alpha2-Rezeptor-Subtypen hauptsächlich im Bereich des Zellsomas zu finden. Neben der räumlich differentiellen Verteilung beider Untereinheiten, konnte auch eine vom Differenzierungsgrad der kultivierten Neurone abhängige Bildung von „Clustern“ beobachtet werden. Erste „Cluster“ der alpha1-Rezeptor-Subtypen waren bereits nach 5 Tagen zu erkennen, während „Cluster“ von alpha2-Rezeptor-Subtypen erst nach 8 Tagen nachweisbar waren. Mit Hilfe der generierten Fusionsproteine konnten in hippokampalen Neuronen neben „Rezeptorclustern“ auch Strukturen beobachtet werden, die aufgrund ihrer Bewegungseigenschaften auf Transportvesikel hindeuten. Diese wiesen im Gegensatz zu den immobilen „Clustern“ eine deutlich höhere Mobilität auf. Während den Untersuchungen zum GABAA-Rezeptor-Transport konnte beobachtet werden, dass hippokampale Neurone und in der Kultur verbliebene Astrozyten durch „tunneling nanotubes“ (TNTs) verbunden waren. Aus diesem Grund wurde ein weiteres Augenmerk auf den TNT-vermittelten, interzellulären Transfer membranöser Strukturen zwischen kultivierten Astrozyten und Neuronen gelegt. Dabei gelang es, den Austausch von kleinen Membranstrukturen zwischen den Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren. Durch Applikation von Zytoskelettgiften konnten Hinweise auf einen F-Aktin-basierten Transfer der übertragenen Strukturen gefunden werden, wenngleich ein endgültiger Beweis für eine Beteiligung von TNTs so nicht zu erbringen war. Um den beobachteten Membrantransfer mit der Existenz von TNT-Strukturen zu korrelieren, wurde deshalb ein spezielles Zellkultivierungssystem - basierend auf mikrostrukturierten Oberflächen - entwickelt. Dieses System erleichterte die Visualisierung von TNT-ähnlichen Strukturen in den Kulturen dramatisch und könnte somit zukünftig eine Korrelation zwischen dem Auftreten von TNT-ähnlichen Strukturen und dem beobachteten Vesikeltransfer ermöglichen.

Translation of abstract (English)

GABAA receptors are pentameric neurotransmitter receptors, which show a strong variety in subunit composition. Different receptor subtypes show thereby a differential distribution at the somato-dendritc membrane of hippocampal neurons. Within the scope of this graduation the differential distribution of GABAA receptor subunits alpha1 and alpha2 in hippocampal neurons was analysed. For this purpose the subunits were fused either at their C- or N-terminal end with GFP colour variants in order to perform a microscopic in vivo analysis of both subunits simultaneously. Employing sensitive surface immunofluorescence stainings and analysing the emited GFP fluorescence of the fusion proteins, receptor chimeras could be detected at the plasma membrane of both, cultivated cell lines and hippocampal neurons - which is consistent with an efficient transport. Via sucrose density gradient centrifugation, it could be shown that in the presence of the wild-type subunits beta2 and gamma2, fusion proteins were able to oligomerise into pentameric receptors. Electrophysiological analysis showed that the receptor chimeras could form functional, GABA sensitive chloride channels. As a consequence the functional fusion proteins were used for microscopic in vivo transportation studies in cultivated hippocampal neurons. It could be shown, that alpha1 and alpha2 receptor subtypes form clusters at different plasma membrane regions. While clusters of alpha1 receptor subtypes were homogeneously distributed at the cellsoma and at the dendritic membrane, clusters of alpha2 receptor subtypes were distributed at the membrane of the cell soma only. In addition to the spatially differing distribution of both subunits, a time dependent formation of receptor clusters, correlated with the neuronal differentiation state, could be observed. Whereas clusters of alpha1 receptor subtypes were recognized after 5 days, clusters of alpha2 receptor subtypes were first detectable after 8 days. During the analysis of the generated fusion proteins, structures other than receptor clusters could be found in hippocampal neurons, indicative of transport vesicles. These structures exhibited a higher mobility rate compared to the immobile clusters. During the analysis of GABAA receptor transport, it could be observed that hippocampal neurons and astrocytes, which remained in the cell cultures, where connected via “tunnelling nanotubes” (TNTs). For this reason further attention was drawn to the TNT-mediated transfer of membranous structures between both cell-types. During these experiments it was achieved to monitor and to quantify the intercellular exchange of small membranous structures. Application of cytoskeleton toxins gave first indications towards an f-actin dependent transfer of transferred structures, even though the involvement of TNTs could not be finally adduced. To simplify the analysis of TNT-based membrane transfer between astrocytes and neurons, a specialised cell-cultivation system - based on microstructured surfaces - was developed. This system facilitated the visualisation of TNT-like structures between cells and could therefore enable to correlate the presence of TNT-like structures and the observed vesicular transfer in the near future.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gerdes, Prof. Dr. Hans-Hermann
Date of thesis defense: 30 January 2007
Date Deposited: 14 Feb 2007 09:13
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Interdisziplinäres Zentrum für Neurowissenschaften
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: GABA-A-Rezeptor, GFP, Fusionsproteine, differentieller Transport, tunneling nanotubes, TNT, mikrostrukturierte Oberflächen
Uncontrolled Keywords: GABA-A-Receptor , GFP , Fusionproteins , differential transport , tunneling nanotubes , TNT , microstructured surfaces
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