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In Vivo Studies on the Transcriptional and Posttranslational Regulation of the CCAAT/Enhancer Binding Protein Beta

Ruffell, Daniela A.

German Title: In Vivo Studien zur transkriptionalen und posttranslationalen Regulation des CCAAT/Enhancer Binding Proteins Beta

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Abstract

The transcription factor C/EBPbeta gene has CREB responsive elements (CRE) in its promoter, and its transcription is regulated by CREB during adipogenesis. We have generated a mouse line with a deletion of the CRE elements on the C/EBPbeta promoter and stusied the role of these elements in macrophages. We show that the CREs are important for the induction of C/EBPbeta expression following treatment of the macrophages with IFNgamma/LPS. Moreover, we found two novel targets for C/EBPbeta transcription in macrophages, that are macrophage scavenger receptor 1 (Msr1) and interleukin 13 receptor alpha1 (IL13a1). We also show that the well-known regulation of the arginase 1 gene by C/EBPbeta is dependent on the ability of CREB to upregulate C/EBPbeta. FACS analyses on our bone marrow-derived macrophage population, showed that the cells are Mac1(+), F4/80(+) and Gr1(+), typical markers of Natural Suppressor macrophages. Taken together, the C/EBPbeta target genes found in the macrophage and the cell surface markers, suggest an immunosuppressive phenotype. we propose a novel role for C/EBPbeta in mediating the molecular switch fron inflammatory to immunosuppressive macrophages. In a separate project, we study the role of the Thr188 and Ser176, Ser180 and Ser184 phosphorylation sites, which are located in the regulatory domain of the C/EBPbeta protein. Thr188 is a known MAPK phosphorylation site, whereas the three serines, whether all or some, were recently shown to be targets for GSK3beta phosphorylation. We created two mouse lines in which either Thr188, or the three serines were mutated to alanines. We analyzed the expression of the mutant C/EBPbeta in various tissues, as well as the expression of C/EBPbeta target genes in primary macrophages from both the mouse lines. We found that the three serines have a role in modulating C/EBPbeta's autoregulatory loop as well as in reducing the transcription factor's transactivational activity. Moreover, based on the migration pattern of the mutant C/EBPbeta proteins, we propose a modl suggesting cooperativity between the MAPK and GSK3beta phosphorylation sites. We conclude that the phosphorylation sites in question are implicated, whether directly or indirectly, in the modulation of the transcription factor's activity.

Translation of abstract (German)

Das Gen des Transkriptionsfaktors C/EBPbeta besitzt CREB sensitive Elemente (CRE) in der Promotorregion. Die Transkription dieses Gens wird in der Adipogenese durch CREB reguliert. Es wurde ein Mausstamm generiert, bei dem die CRE Elemente des C/EBPbeta-Promotors entfernt wurden. Die Rolle dieser Elemente wurde in Makrophagen untersucht. Es wird gezeigt, dass diese CREs wichtig sind für die Indiktion der C/EBPbeta-Expression nach Stimulierung von Makrophagen mit IFNgamma/LPS. Darüber hinaus wurden zwei neue Gene gefunden, deren Transkription von C/EBPbeta reguliert wird, der Makrophagen scavenger receptor 1 (Msr1) und Interleukin 13 Rezeptor alpha1 (IL13a1). Des weiteren wird gezeigt, dass die bereits bekannte Regulation des Arginase 1 Gens durch C/EBPbeta von einer CREB induzierten Aktivierung der C/EBPbeta Transkription abhängig ist, FACS Analyse zeigte, dass aus Knochenmark gewonnene Makrophagen (Mac1, F4/80, und Gr1) waren. Die gefundenen C/EBPbeta-regulierten Gene in Makrophagen und die Zelloberflächenmarker legen nahe, dass es sich um einen Mausphänotyp mit eingeschräanktem Immunsystem handelt. In einem weiteren Projekt wurde die Rolle der Kinasesubstrate Ser176, Ser180, Ser184 und Thr188 untersucht. Diese Aminosäuren befinden in der regulatorischen Untereinheit des C/EBPbeta Proteins. Thr188 ist eine bekannte Phosphorylierungsstelle für MAPK, während die drei Serine zumindest teilweise von GSK3beta phosphoryliert werden. Es wurden Mausstämme generiert, bei denen entweder Thr188 oder die drei Serine zu Alaninen mutiert wurden. Die Expression der C/EBPbeta Mutanten wurde in verschiedenen Geweben und die Expression von C/EBPbeta-regulierten Genen in primären Makrophagen der beiden Mausstämme untersucht. Die drei Serine spielen eine Rolle sowohl bei der Modulation der autoregulatorischen Schleife, als auch bei der Verringerung der Aktivität des Transkriptionsfaktors. Das Migrationsmuster der mutierten C/EBPbeta Proteine legte einen synergistischen Effekt der Phosphorylierung durch MAPK und GSK3beta nahe. Aus den Ergebnissen kann geshlossen werden, dass die Phosphorylierungsstellen entweder direkt oder indirekt die Aktivität des Transkriptionsfaktors modulieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Nerlov, Dr Claus
Date of thesis defense: 13. March 2006
Date Deposited: 20. Apr 2007 09:21
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: C/EBPbeta , transcription , phosphorylation , macrophages
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