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Molecular characterization of the Drosophila mitotic inhibitor Frühstart

Pawel, Gawlinski

German Title: Molecular characterization of the Drosophila mitotic inhibitor Frühstart

English Title: Molecular characterization of the Drosophila mitotic inhibitor Frühstart

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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die biochemische, molekulare und genetische Charakterisierung des Drosophila Gens frühstart. In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, daß Frs als mitotischer Inhibitor wirkt, der spezifisch der Funktion der Protein-Phosphatase String entgegenwirkt, dadurch die Mitosen in den Zellen der Ventralfurche verzögert und so diesen Zellen erlaubt, die für die Ventralfurchenbildung erforderlichen morphogenetischen Prozesse ohne Störungen durch mitotische Zellteilungen zu durchlaufen. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß frs ausreichend und zum Teil notwendig ist, um die schnellen syncytialen Kernteilungen nach der 13. Teilung und während der nachfolgenden Zellularisierung auszusetzen. Die vorliegende Arbeit beschreibt verschiedene weitergehende und bisher unbekannte physiologische und biochemische Eigenschaften von Frs. So wird gezeigt, daß durch die ektopische Expression von Frs in späteren embryonalen Entwicklungsstadien auch der reguläre Zellzyklus inhibiert werden kann, diese Inhibition durch Blockierung der M-Phase verursacht wird und der damit verbundene direkte Übergang von der G2 zur G1 Phase zu Endoreplikationen in den betroffenen Zellen führt. Dieser durch Frs-Überexpression verursachte Phänotyp ist konsistent mit den Phänotypen von Cdk1 und CycA Mutanten. Um eine molekulare Verbindung zwischen Cdk1 und Frs herstellen zu können, wurde in dieser Arbeit nach mit Frs interagierenden Faktoren gesucht, deren Interaktionen mit Hilfe vielfältiger biochemischer Methoden analysiert wurden. Frs interagiert hauptsächlich mit zwei verschiedenen Arten von Proteinen: Nukleoporinen und Cyclinen. Durch molekulare in vitro Analyse konnte gezeigt werden, daß die Aminosäuresequenz von Frs neben einer Leuzinreichen Region (putatives NES), die für die Bildung des Frs-Nup50-Komplexes notwendig ist, zwei Haupt-Phosphorylierungsstellen (T22 and T48) und ein KxL-Motiv enthält, das essentiell für die direkte Interaktion von Frs mit dem hydrophoben Patch von Cyclinen ist. Die physiologische Funktion dieser Motive wurde in Rescue-Experimenten überprüft. So konnte gezeigt werden, daß das KxL-Motiv essentiell für die Frs-Funktion im Embryo ist. Die beiden Phosphorylierungsstellen tragen in vivo teilweise, das putative NES-Motiv hingegen überhaupt nicht zur antimitotischen Aktivität von Frs bei. Mit Hilfe von surface-plasmon-resonance-Analyse wurde zudem gezeigt, daß Frs bevorzugt an mitotische Cycline bindet und eine viel höhere Affinität für das mitotische Cyclin A als für das G1/S spezifische Cyclin E aufweist. Mit der gleichen Methode konnte keinerlei Interaktion von Frs mit der Cdk-Untereinheit nachgewiesen werden. Somit unterscheidet sich das Bindungsverhalten von Frs von dem bereits bekannter Mitglieder der Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor-Familien INK4 und CIP/KIP, was darauf schließen läßt, daß die Funktion von Frs auf einem neuen Mechanismus der Cdk-Inhibierung basiert. Zusammenfassend bleibt festzustellen, daß die Bindung von Frs an den hydrophoben Patch ausreichend ist, um den Eintritt in Mitose 14 zu inhibieren und das der hydrophobe Patch somit eine wichtige Rolle in der Zellzyklusregulation während des Drosophila- Midblastula-Übergangs spielt.

Translation of abstract (English)

The aim of this study was biochemical, molecular and genetic characterization of the Drosophila gene frühstart. Previous analysis revealed that Frühstart is a mitotic inhibitor that specifically counteracts protein phosphatase String and in this way delays mitosis in the ventral furrow cells to prevent an interference of mitotic events and morphogenetic movements during ventral furrow formation. Subsequent studies demonstrated that frs is also sufficient and partially required for pausing the rapid nuclear cycles after the last (13th) cleavage division during cellularisation process. This study revealed several unknown physiological and biochemical features of Frs. Ectopic expression of Frs in later stages of Drosophila embryonic development, revealed that Frs can also inhibit normally occurring cell cycle and shortcut G2 with G1 phases by blocking M phase, what leads the cell cycle to endoreplication process. The endoreplication phenotype caused by Frs over-expression is consistent with the Cdk1 or CycA phenotype, when the physiological function of one of them is disrupted. To find a molecular link between mitotic Cdk1 and Frs, a set of Frs biochemical interactors was found and the interactions were analysed in a wide range of molecular techniques. It was shown that Frs interacts with two different sets of proteins: nucleoporins and cyclins. Molecular analysis of the amino acid sequence of Frs revealed leucine rich region (putative NES) that is required for Frs-Nup50 complex formation, two main phosphorylation sites (T22 and T48) and a KxL motif that is essential for direct interaction with the hydrophobic patch of cyclins. The physiological meaning of these motifs was confirmed by frs ventral furrow rescue phenotype assay, which showed that the KxL motif that is required for proper Frs-Cyclins complex formation in vitro is also essential for Frs function in the embryo. Moreover, the rescue assay revealed that the two main phosphorylation sites of Frs appear to be partially required for proper Frs activity whereas the putative NES motif that is required for interaction with nucleoporins is not essential for Frs anti-mitotic activity in vivo. The surface plasmon resonance data demonstrated a binding preference of Frs for mitotic cyclins and showed that Frs has much higher affinity for mitotic CycA compared to G1/S CycE. Moreover, no interaction with the Cdk subunit was observed in contrast to the members of two already established cyclin dependent kinase inhibitor families INK4 and CIP/KIP. This showed that the function of Frs is based on a new mechanism of Cdk inhibition. In this work I demonstrated that blocking of the hydrophobic patch by Frs is sufficient to inhibit entry into mitosis 14 and that the hydrophobic patch plays an important role in cell cycle regulation during Drosophila mid-blastula transition.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Herbert (Professor), Steinbeisser
Date of thesis defense: 26 February 2007
Date Deposited: 16 Mar 2007 16:43
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 500 Natural sciences and mathematics
Uncontrolled Keywords: Frühstart , DrosophilaFruhstart , Drosophila , inhibitor
Additional Information: Teile in: Gawlinski et al., EMBO R. 2007
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