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Frühe Schritte der Enten Hepatitis B Virus Infektion : Zellassoziation und intrazelluläre Degradation als Hauptdeterminanten der Infektionseffizienz in vivo und in vitro

Scheirich, Iris Eva Maria

English Title: Early steps of Duck Hepatitis B Virus infection : cell-association and intracellular degradation as key determinants of infection efficiency in vivo and in vitro

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Abstract

Die frühen Schritte einer Infektion, d.h. Anheftung der Viren an und Aufnahme in die Zelle, sind entscheidend für die hohe Wirts- und Gewebsspezifität der Hepatitis B Viren und somit den Erfolg der Infektion. Diese sind aber bisher auf molekularer Ebene nur unzureichend verstanden. Eine Ursache hierfür ist die ineffiziente Infektion primärer Hepatozyten, die im Gegensatz zu der äußerst effizienten Infektion in vivo steht. Um sich Einblicke in die Unterschiede der beiden Systeme zu verschaffen, wurde in dieser Arbeit am Tiermodell des Enten Hepatitis B Virus (DHBV) erstmals quantitativ die in vivo Infektion der Pekingente mit der in vitro Infektion primärer Entenhepatozyten verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anheftung der Viren in der Leber in vivo im Gegensatz zu in vitro schnell und äußerst effizient erfolgt. Dieser Unterschied könnte auf dem aktiven Transport der Viren durch den Blutstrom in die Leber und auf der höheren Konzentration der Viren in der Leber beruhen. Ein weiterer Unterschied der beiden Systeme zeigte sich vermutlich bedingt durch den Zustand der Zellen im Verlauf der produktiven Primärinfektion, die in vivo bereits nach einem, in vitro erst nach drei Tagen detektierbar war. Nach der Aufnahme der Viren in die Zellen wurde in beiden Infektionssystemen aufgrund eines intrinsischen Abwehrmechanismus ein großer Teil der Viren abgebaut. Von den persistierenden Viren führte mindestens jedes zehnte zu einer Infektion, was zeigt, dass die Viruspartikel im Gegensatz zu vielen anderen Viren hoch infektiös sind. Die Ausbreitung der Infektion erfolgte in beiden Systemen synchron und bevorzugt auf die umliegenden Zellen. Dies lässt sich durch die lokal erhöhte Konzentration der Nachkommenviren erklären, zusätzlich in vivo begünstigt durch die dreidimensionale Struktur der Leber. Die Suche nach weiteren stimulierenden Faktoren führte zu der Beobachtung, dass Hepatozyten in der Umgebung von Zellen, die das virale Hüllprotein exprimierten, vermehrt infiziert wurden. Um den Eintrittsmechanismus der Viren in die Zelle aufzuklären, wurde im zweiten Teil der Arbeit eine detaillierte in vitro Analyse der Zellassoziation der Viren und der nachfolgenden Schritte durchgeführt. Folgende Erkenntnisse konnten erlangt werden: Die Bindung und Infektion von DHBV ist konzentrations- und zeitabhängig und wird nicht durch eine Sättigung des primären Rezeptors limitiert. Überexpression des zellulären Interaktionspartners Carboxypeptidase D in Hepatozyten zeigte, dass dieser Faktor die Primärbindung der Viren an die Zellen nicht limitiert. Die Inokulation von Viren bei tiefen Temperaturen führte zu einer drastischen Reduktion der Infektion, während die Zellassoziation weitgehend unbeeinflusst blieb. Dies zeigt, dass die im Fall von DHBV beobachtete Bindung der Viren bei tiefen Temperaturen, wie sie bei vielen anderen Viren durchgeführt wird, um die Zellassoziation und Infektion zu synchronisieren, nicht die produktive Bindung reflektiert. Mit Hilfe replikationsdefizienter rekombinanter Viren wurden die Schritte der produktiv werdenden Viruspartikel verfolgt, woraus ein mehrstufiges Modell abgeleitet werden konnte. Eingangs erfolgt eine reversible Bindung der Viren an die Zelloberfläche, die sensitiv gegenüber neutralisierenden Antikörpern ist. Die anschließende energieabhängige, irreversible Bindung ist Antikörper-resistent, jedoch noch Säure-sensitiv und erfolgt nicht bei niedriger Temperatur. Die Internalisierung der Viren zu einem dritten, Säure-resistenten, Zustand vollzieht sich sehr langsam. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die wesentlichen Unterschiede der DHBV-Infektion in vivo und in vitro nur vor, aber nicht nach der Zellassoziation liegen. Die Infektion begleitende Degradation von Viruspartikeln in Leberzellen stellt eine wesentliche Determinante der Infektionseffizienz von Hepadnaviren dar, die in vivo und in vitro in gleichem Maße erfolgt. Diese Verteidigungsstrategie des Organismus wird jedoch durch die effiziente Ausbreitung der Infektion erfolgreich umgangen.

Translation of abstract (English)

The early steps of hepatitis B virus infection, i.e. binding and uptake of viruses into cells, determine the narrow host and tissue specificity and consequently the outcome of infection. However, the molecular basis of these steps is poorly understood. This lack of knowledge is caused by the inefficient infection of primary hepatocytes (in contrast with an efficient in vivo infection). To gain insights into the differences between the in vivo and in vitro systems using, for the first time, a quantitative approach, the duck hepatitis B virus (DHBV) animal model was used to compare directly the in vivo infection of Peking ducks to the in vitro infection of primary duck hepatocytes. The results showed that the attachment of viruses to liver cells in vivo was, in contrast to in vitro, fast and very efficient. This difference might be based on an active transport of viruses to the liver and a higher virus concentration within the liver. Another difference observed was the detection of productively DHBV infected hepatocytes after 24 hours in vivo, but only from day 3 in vitro. Upon virus uptake into cells, degradation of the majority of viruses was observed in both systems, representing an intrinsic defense mechanism. One out of ten persisting viruses lead to an infection, indicating that DHBV virus particles are highly infectious, in contrast to other virus families. Synchronous spread of progeny virus was observed in vivo and in vitro and predominantly involved neighboring cells. This observation can be explained by the local concentration of progeny virus, which is even higher in vivo due to the three-dimensional structure of the liver. The search for further stimulating factors lead to the observation that cells were preferentially infected adjacent to cells expressing viral surface proteins. In the second part of the thesis, analysis of viral cell association and subsequent steps was performed in vitro in order to elucidate the entry mechanism of DHBV into hepatocytes. The following results were obtained: binding and infection of DHBV to hepatocytes is concentration- and time-dependent and is not limited by saturation of primary receptors. Overexpression of the cellular interaction partner carboxypeptidase D (CPD) in hepatocytes showed that CPD is not limiting primary binding and infection. Inoculation at low temperatures resulted in a drastically reduced infection, while binding was only slightly diminished. This result indicates that for DHBV, virus binding at low temperature, a standard procedure for many other viruses to synchronize infection, does not necessarily reflect productive binding. Replication-defective recombinant viruses were used to track productive virus particles. The results lead to a multi-step entry model. 1) Primary binding of DHBV at the cell surface is reversible, exemplified by its sensitivity to the action of neutralizing antibodies. 2) The subsequent energy-dependent and irreversible binding did not occur at low temperature and was characterized by its resistance to the action of neutralizing antibodies and its sensitivity to an acidic shift. 3) Internalization of virus particles, characterized by insensitivity to an acidic shift occurred extraordinarily slowly (half of the viruses are cell surface bound after 24 hours). Taken together, these data show for the first time that the major differences of DHBV infection in vivo and in vitro are only based on cell association. Subsequent steps during infection are comparable. Degradation of virus particles in liver cells is the major determinant for infection efficiency of hepadnaviruses in vivo and in vitro. This defense mechanism is compensated by the efficient spread of infection.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schaller, Prof. Heinz
Date of thesis defense: 7. December 2006
Date Deposited: 27. Mar 2007 15:27
Date: 2006
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hepatitis-B-Virus, In vivo, Zellkultur, Grün fluoreszierendes Protein, Effizienz
Uncontrolled Keywords: rekombinante Hepadnavirenrekombinant fluorescent Hepadnaviruses
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