English Title: Molecular mechanism of aldosterone effects and interactions of the mineralocorticoid receptor in kidney cells

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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit sollten Interaktionen des Mineralocorticoid-Rezeptors (MR) sowie Regulationsmechanismen des MR durch Aldosteron in Nierenzellen untersucht werden. In früheren Versuchen am Institut für Klinische Pharmakologie Mannheim wurde die schnelle (2h) Aldosteron-induzierte Genexpression in Zellen des distalen Tubulusepithels (DTEC) untersucht. Unter den in einem Mikroarray differentiell regulierten Genen wurden mehrere Proteine ausgewählt, deren Einfluss auf MR-Signalwege näher untersucht werden sollte. Es stellte sich heraus, dass die Eigenschaften unterschiedlicher Isolate der primären DTEC so stark variierten, dass keine signifikanten Resultate erreicht werden konnten. Auf die weitere Verwendung dieser Zellen wurde deshalb verzichtet. Untersuchungen an Steroidrezeptoren haben gezeigt, dass Kofaktoren eine wichtige Rolle für die Wirkung von Steroiden spielen. Auch für die Wirkung von Steroiden am MR haben solche Protein-Protein-Interaktionen sehr wahrscheinlich eine entscheidende Bedeutung. Während die Rekrutierung von Kofaktoren für die meisten Steroidrezeptoren gut untersucht ist, ist für den MR hierüber noch wenig bekannt. Mögliche Interaktionspartner des MR sollten daher mittels Affinitätschromatographie und anschließender massenspektrometrischer Analyse identifiziert werden. Hierfür wurden parallel verschiedene Systeme untersucht. Die höchsten Ausbeuten an Zielprotein, bei einem niedrigen Hintergrund an unspezifisch gebundenen Proteinen, lieferte ein System mit einer Streptavidin-Affinitätssequenz. Dieses wurde für alle Versuche im Großmaßstab eingesetzt. Es wurden zahlreiche Proteine identifiziert, die sich mit dem zytosolischen MR in einem Komplex befinden, darunter alle in der Literatur bereits beschriebenen. Die Komplexbestandteile können in folgende Gruppen eingeteilt werden: 1.Hitzeschockproteine/Chaperone 2.Proteine des intrazellulären Transportapparates 3.Metabolische Enzyme 4.Elongationsfaktoren 5.Sonstige Die relativ große Anzahl an isolierten Proteinen weist auf die Bildung von MR-Multiproteinkomplexen hin, wie dies bereits für den Glucocorticoid-Rezeptor gezeigt wurde. Zu den identifizierten Proteinen gehören bereits gut dokumentierte Interaktionen des MR (Hitzeschockproteine HSP70 und HSP90, Aktin, Tubulin), als auch bislang noch nicht für den MR, jedoch für andere Steroidrezeptoren beschriebene Interaktionspartner (p23, 14-3-3, GRP78, Elongationsfaktoren eEF1 und eEF2). Daneben wurden zahlreiche neue Proteine im MR-Komplex identifiziert. Um die differentiellen Wirkungen unterschiedlicher MR-Liganden zu verstehen, wurde die Liganden-abhängige Rekrutierung von Kofaktoren untersucht. In Gegenwart des Agonisten Aldosteron waren HSPs zu verschiedenen Zeitpunkten erwartungsgemäß in deutlich geringerer Menge an den zytosolischen MR gebunden als im unstimulierten Zustand. Außerdem wurden zwei Proteine identifiziert, die abhängig vom gebundenen Liganden im MR-Komplex gefunden wurden. GRP78 und -Propionyl-CoA-carboxylase Vorläufermolekül wurden beim unstimulierten MR wie auch nach einer Stimulation mit Aldosteron isoliert, jedoch nicht mehr nach einer Inkubation mit Spironolacton. Diese Befunde könnten auf eine bisher unerkannte Komplexität der Wirkung von MR Antagonisten hindeuten.

Translation of abstract (English)

Within the scope of this project, interactions of mineralocorticoid receptor (MR) as well as regulatory mechanisms of MR induced by aldosterone should be examined. In earlier experiments at the Department of Clinical Pharmacology Mannheim, the early (2h) aldosterone induced gene expression in distal tubular cells (DTEC) was investigated. Among the genes differentially regulated by aldosterone in a microarray experiment, several proteins were selected, of which the influence on MR signalling pathways was to be analysed. However the properties of individual cell preparations of primary DTECs turned out to vary to an extent that no significant results could be achieved. The further use of these cells was abandoned. Studies on steroid receptors have shown that cofactors play an important role for the effects of steroids. Such protein-protein-interactions are likely to be important for the effects of steroids on the mineralocorticoid receptor (MR) as well. Whereas the recruitment of cofactors has been studied in detail for most steroid receptors, little is known in the context of MR. Thus, possible interaction partners of MR should be identified by affinity chromatography followed by mass spectrometry. To this end, several systems were tested. The highest recovery of the target protein was achieved with a system using a streptavidin affinity sequence, which has been used for all large scale experiments. Numerous MR binding proteins were identified, which form a complex together with cytosolic MR. The complex components can be classified into the following groups: 1.Heat shock proteins / chaperones 2.Proteins of the intracellular transport machine 3.Metabolic enzymes 4.Elongation factors 5.Other The relatively high number of isolated proteins indicates a formation of several MR multiprotein complexes, as shown for the glucocorticoid receptor. Among the identified proteins, both well documented interactors of MR (heat shock proteins HSP70 and HSP90, actin, tubulin) and interaction partners not yet described for MR but for other steroid receptors (p23, 14-3-3, GRP78, elongation factors eEF1 and eEF2) were found. In addition, new putative MR binding proteins were identified. In order to understand the differential effects of various MR-ligands, the ligand dependent recruitment of cofactors was studied. As expected, in the presence of the agonist aldosterone HSPs were bound to MR in a smaller quantity compared to non-stimulated conditions at different time points. Furthermore, two proteins were identified that bound to the MR-complex depending on the ligand used. GRP78 and β-propionyl-CoA-carboxylase precursor were isolated in a complex with non-stimulated and aldosterone-stimulated MR, but no longer after incubation with spironolactone. These findings could indicate a hitherto unrecognized complexity of action of MR antagonists.