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Integration von Rezeptoren in inerte Matrices zur markierungsfreien und quantitativen Detektion biospezifischer Wechselwirkungen mit LSPR-aktiven Nanopartikeloberflächen

Buecker, Petra

English Title: Integration of receptors into inert matrices for the label-free and quantitative detection of biospecific interactions with LSPR-active nanoparticle-surfaces

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Abstract

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation und den Einsatz optisch aktiver Nanopartikeloberflächen in der Immundiagnostik. Diese Sensoroberflächen bestehen aus oberflächen-adsorbierten Core-shell Partikeln (Nanopartikel mit einem dielektrischen Kern und einer metallischen Hülle) und zeigen ausgeprägte Resonanzen im sichtbaren Spektralbereich, die auf eine Anregung von sowohl lokalisierten als auch propagierenden Oberflächenplasmonenresonanzen zurückgeführt werden können. Da die Resonanzlage empfindlich gegenüber Änderungen des umgebenden Brechungsindex reagiert, kann sie zu einer markierungsfreien Detektion und Quantifizierung von Bindungsereignissen eingesetzt werden. Durch die kombinierte Anregung von lokalisierten und propagierenden Plasmaschwingungen resultieren im Vergleich zur konventionellen SPR sowohl höhere optische Extinktionswerte (Steigerung um etwa 3 Größenordnungen), die ein verbessertes Signal/Rausch-Verhältnis zur Folge haben, als auch eine höhere Sensitivität gegenüber Änderungen der dielektrischen Eigenschaften ihrer unmittelbaren Umgebung; bezüglich der Adsorption von Oktadekanthiol konnte eine etwa 5-fache Sensitivitätssteigerung erzielt werden. Zudem bietet das Dicken¬verhältnis von Kern/Schale einen weiteren Parameter, durch den die Resonanzlage über den gesamten sichtbaren Bereich verschoben und somit gezielt außerhalb des Absorptionsfensters von Störkomponenten platziert werden kann. Anhand geeigneter Kalibrationsmessungen und Bindungsstudien wurde gezeigt, dass analog zur konventionellen SPR in dem analysierten Bereich von Massenbelegungen bis hin zu 600 ng/cm2 und einer lateral gemittelten Schichtdicke von 75 Å (lokale Maximalwerte ~ 24 nm) keine Minderung der Sensorantwort eintritt und eine lineare Beziehung zur Resonanzverschiebung besteht. In verschiedenen immunodiagnostischen Anwendungen (Antikörper-Antigen-, Peptid-Antikörper-Assays) konnten die Bindungsereignisse daher nicht nur detektiert, sondern mittels der zuvor bestimmten Eichwertfaktoren auch quantifiziert werden, wobei eine gute Übereinstimmung zu den anhand anderer Analysemethoden (XPS, ELISA) erhaltenen Massenbelegungen und Schichtdicken erhalten wurde. Im Vergleich zur konventionellen SPR besitzen diese Systeme weitere Vorteile, die vor allem einen Einsatz im Mikroarray-Format betreffen. Die Möglichkeit zu einer sehr viel höheren lateralen Auflösung (theoretisch im Nanometerbereich) sowie die technisch einfache Art der markierungsfreien Detektion sprechen für einen direkten Einsatz in hoch parallelisierten und miniaturisierten Biochips (DNA-, Peptid- und Protein-Arrays), in denen eine Vielzahl an Bin¬dungsereignissen ortsaufgelöst und simultan (bei Einsatz einer CCD-Kamera) bestimmt werden können. Zur Demonstration einer solchen Applikation wurden photochemisch strukturierte Oberflächenbeschichtungen erzeugt und mittels LSPR-Imaging ausgelesen; diese wurden anschließend fluoreszenzspektroskopisch visualisiert, wobei eine gute Übereinstimmung bezüglich Geometrie und Ausmaße der erzeugten Strukturen erhalten wurde. Eine eindeutige Detektion und Quantifizierung biomolekularer Wechselwirkungen setzt jedoch die Spezifität der beobachteten Bindungsereignisse voraus. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit betraf daher die Erzeugung von Oberflächenbeschichtungen auf Polyethylenglykolbasis, die geeignete Funktionalitäten zu einer Integration von Rezeptoren für immunodiagnostische Anwendungen aufweisen, eine unspezifische Adsorption jedoch weitgehend unterdrücken. Hierzu wurden endgruppenfunktionalisierte (OH, COOH, NH2) Polyethylenglykolthiole unterschiedlicher Kettenlängen (15 – 40 EG-Einheiten) synthetisiert und nach der Adsorption auf Au-bedampften Si-Wafern hinsichtlich ihrer Bindungskapazität und Proteinresistenz untersucht. Unabhängig von der Art der Terminierung ergab sich eine deutliche Abhängigkeit der Resistenz von der Kettenlänge, wobei mit zunehmender EG-Anzahl ein Anstieg der Proteinresistenz beobachtet wurde. Aber auch die Endgruppe zeigte einen entscheidenden Einfluss auf die Adsorptionsrate; bezüglich der funktionellen Terminierung konnte folgende Resistenzreihe aufgestellt werden: NH2 < COOH << OH. Unabhängig von der Kettenlänge erfordert vollständige Proteinresistenz eine elektrostatische Neutralität der erzeugten Beschichtung. Im Fall durch Protolyse geladener Oberflächenfunktionalitäten resultieren höhere Adsorptionsraten bei positiver Ladung (protonierte Aminogruppen), die auf verstärkte Wechselwirkungen mit den üblicherweise negativ geladenen Proteinen zurückgeführt werden können. Weiterhin zeigte sich, dass eine Zunahme der Proteinresistenz mit einer abnehmenden Antikörper-Bindungsrate verbunden ist. In immunodiagnostischen Anwendungen muss daher über die Parameter der Endgruppenfunktionalität und Kettenlänge ein geeigneter Kompromiss zwischen Proteinresistenz und Rezeptor-Dichte eingestellt werden.

Translation of abstract (English)

The present work describes the preparation of optically active nanoparticle layers and their application as a label-free detection tool in immunodiagnostics. The sensor surface consists of surface-adsorbed core-shell particles (nanoparticles with a dielectric core and a metal shell) and shows pronounced optical extinctions in the visible range of the electromagnetic spectrum, which are due to a combined excitation of localized and propagating surface plasmons. Since the peak position of the excitations depends very sensitively on changes of the refraction index in the vicinity of the surface, the nanoparticle layers can be used for the label free and quantitative detection of binding events. Due to a combined excitation of localized and propagating surface plasmons, these surfaces show higher optical extinctions (increase up to three orders of magnitude) compared to isolated metal nanoparticles, leading to an improved signal to noise ratio as well as an enhanced sensitivity towards changes of their direct nano-environment. Concerning the adsorption of organic molecules, the resonance-shift can be increased fivefold with respect to established biosensors based on conventional surface plasmon resonance (SPR). In addition, the ratio of the core- to shell-radii offers another parameter by which the resonance position can be varied within the whole visible regime. Thus, it can be deliberately shifted outside the adsorption window of the respective solvent (e.g. buffer solution, plasma or whole blood) in order to avoid interference. By means of appropriate calibration measurements and antibody-binding studies it has been shown, that - analogous to conventional SPR – a linear relationship exists between the sensor response (i.e. the wavelength shift of the extinction peak) and the surface mass density or thickness of the adsorbed layers in the examined regime of surface mass densities up to 600 ng/cm2 and average film thicknesses of 75 Å (with local maxima around 24 nm). These calibration factors could be used in various immunodiagnostic assays (antibody-antigen-, peptide-antibody-assays) for a label-free and quantitative detection of binding events. Thereby, very good agreement was obtained between the localized surface plasmon (LSPR) based determination of surface mass densities and layer thicknesses and the ones measured by other analytical methods such as x-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Compared to conventional SPR, these nanoparticle systems show further advantages, mainly concerning the integration of this detection technique into a microarray format. The opportunity to achieve much higher lateral resolution as well as the simple detection scheme suggest a direct application in highly parallelised and miniaturised biochips (protein-, peptide- and DNA-chips), in which multiple binding events can be read out simultaneously (by use of CCD-cameras) on small scale. To demonstrate such applications, the nanosensor surfaces were functionalised with photochemically structured surface coatings and the resulting pattern was visualized using LSPR-imaging. Additionally, fluorescence images have been taken from the surface after an appropriate labelling of the generated structures. These images showed very good correspondence to the LSPR-images with respect to the geometry and dimensions of the photo-generated pattern. Since the specific detection and quantification of biomolecular interactions requires the suppression of non-specific binding events, another focus of this work was placed on the preparation of protein-resistant polyethylene(glycol) (PEG) coatings with appropriate functionalities for the integration of typically used immunodiagnostical receptors while effectively suppressing non-specific adsorption processes. For that purpose, endgroup-functionalized (OH, COOH, NH2) PEG-thiols with different chain lengths were synthesized and adsorbed onto gold coated silicon wafers for determination of their binding capacity and protein resistance. Independent of the kind of termination, a strong dependence of the resistance on the chain length was found, whereby an increasing ethylene glycol (EG) content resulted in enhanced protein repulsion. Additionally, a strong impact of the chemical end group of the PEG thiols on the adsorption behaviour was revealed. Regarding the functional termination, the following order of protein resistance was found: NH2 < COOH << OH. Thus, independent of the chain length, effective protein repulsion requires electrostatic neu¬trality of the generated surface coating. In case of proteolytic matrix functionalities, higher adsorption rates occur in case of positive charges (protonated amino groups) due to enhanced electrostatic interactions with proteins, which usually exhibit negative net charges. Furthermore, it could be shown that an increasing protein resistance is associated with a decreasing antibody coupling capacity. Hence, an appropriate balance between protein resistance and receptor density has to be chosen in immunodiagnostical applications by carefully selecting the type of endgroup and the chain length of the respective PEG layer.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Dahint, Dr. rer. n Reiner
Date of thesis defense: 22 March 2007
Date Deposited: 13 Apr 2007 10:34
Date: 2007
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Polyethylenglykole, Nanopartikel
Uncontrolled Keywords: lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz , markierungsfreie Detektion , Proteinresistenzpolyethyleneglycole , nanoparticles , localized surface plasmon resonance , protein-resistance
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