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Biochemische und zellbiologische Charakterisierung des Retromer-vermittelten Proteintransports in Pflanzen

Heinzerling, Oliver

English Title: Biochemical and Cell Biological Characterisation of Retromer-mediated Protein Transport in Plants

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Abstract

Rezeptoren saurer Hydrolasen, die für das Lysosom in Säugerzellen oder die Vakuole in Hefen bestimmt sind, zyklieren zwischen dem Golgi-Apparat und dem prävakuolären Kompartiment (PVC). Ihr Rücktransport vom prävakuolären Kompartiment zum Golgi-Apparat geschieht mit Hilfe eines pentameren Proteinkomplexes, dem sogenannten Retromer. Dieser Komplex wird an die Membran des PVC rekrutiert und bindet die Hydrolase-Rezeptoren. Der Retromerkomplex besteht aus zwei Subkomplexen, einem großen aus Vps35, Vps26 und Vps29 und einem kleinen aus Vps5 und Vps17 (vps für vacuolar protein sorting). Während der größere vermutlich die Frachtauswahl bedingt, ist der kleinere möglicherweise für die Vesikelbildung verantwortlich (Seaman et al., 1998). Seit der ersten Arbeit zu Vps35 aus Hefe (Paravicini et al., 1992) gelang es verschiedenen Arbeitsgruppen weitere strukturelle Bestandteile des Retromerkomplexes in Hefe und Säugern zu identifizieren und den retromervermittelten Transport vakuolärer bzw. lysosomaler Sortierungs¬rezeptoren auch funktionell zu charakterisieren (Haft et al., 2000; Seaman et al., 1998; Seaman, 2004; Arighi et al., 2004). In Pflanzenzellen hingegen lagen keinerlei dementsprechende Informationen zur Existenz oder Funktion eines retromervermittelten Transports vor. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Gene der den Hefen und Säugern homologen Retromerproteine AtVps35, AtVps26, AtVps29 und AtVps5 aus Arabidopsis identifiziert und aus cDNA isoliert. Die Proteine des großen Retromersubkomplexes wurden rekombinant exprimiert und Antikörper gegen deren GST-Fusionsproteine hergestellt. Mit Hilfe dieser Antikörper konnten in Pflanzenzellen AtVps35, AtVps26 und AtVps29 sowohl cytosolisch wie auch membrangebunden nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es die Anwesenheit eines möglichen Retromerkomplexes in Salzextrakten von Arabidopsismikrosomen nachzuweisen und seine Größe durch Gelfiltration zu bestimmen. Dieser Komplex koequilibrierte im Saccharose¬dichtegradienten mit Membranen des PVC und mit Membranen aus hochdichten Fraktionen. Immunogoldmarkierung dieser Membranen aus den hochdichten Fraktionen mit Retromerantikörpern zeigte Markierungen von 90 nm großen proteinbeschichteten Mikrovesikeln bei denen es sich möglicherweise um retromerbeschichtete Vesikel handelt. CLSM-Immunfluoreszenzmikroskopie an Tabak-BY-2 Zellen zeigte ein hohes Maß an Kolokalisation der Retromermarkierungen mit denen der PVC-Marker AtPep12 und VSRAt 1. Die Anwesenheit der pflanzlichen Retromerproteine an der Oberfläche der multivesikulären Körper (MVBs) konnte zusätzlich an hochdruckgefrorenen und anschließend gefriersubstituierten BY-2 Zellen elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden. Die Behandlung der BY 2 Zellen mit Wortmannin führte zu einem Anschwellen des PVCs und einer Trennung der vormals kolokalisierten Vps35- und VSR-Signale. Durch Immunpräzipitation konnte eine Interaktion von AtVps35 mit dem vakuolären Sortierungsrezeptor VSRAt-1 nachgewiesen werden. Alle diese Daten lassen auf eine Beteiligung der retromerbeschichteten Vesikel am retrograden Proteintransport vom PVC zum Golgi-Apparat schließen. Damit stützt diese Arbeit die Hypothese, dass der Rücktransport von vakuolären Sortierungsrezeptoren aus dem PVC nicht nur selektiv sondern auch retromervermittelt geschieht. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen somit ferner die Auffassung, dass die Transportmaschinerie zum lytischen Kompartiment und das Rezeptorrecycling zwischen den endosomalen oder prävakuolären Kompartimenten und dem trans-Golgi-Netzwerk (TGN) grundsätzlich bei allen Eukaryoten, also auch den Pflanzen, hochkonserviert ist.

Translation of abstract (English)

Receptors of acid hydrolases destined for the vacuole in yeast and the lysosome in mammalian cells cycle between the Golgi and the prevacuolar compartment. Their retrograde transport from the prevacuolar compartment occurs with the help of a pentameric protein complex, the so-called retromer. This complex is recruited at the membrane of the PVC and binds the receptors. The retromer complex has two subunits, a larger one consisting of Vps35, Vps29, Vps26 and a smaller one with Vps17 and Vps5. While the large subunit selects cargo, the small one may drive vesicle budding (Seaman et al., 1998). After the first results on Vps35 had been been obtained on yeast (Paravicini et al., 1992), several groups succeeded in identifying further components of the retromer complex in yeast and mammals and also characterised retromer-mediated transport of vacuolar or lysosomal sorting receptors (Haft et al., 2000; Seaman et al., 1998; Seaman, 2004; Arighi et al., 2004). At the outset of this work there was no information available on the existence or function of a retromer-mediated transport in plant cells. In the present dissertation Arabidopsis homologues to the retromer proteins AtVps35, AtVps26, AtVps29 and AtVps5 from yeast and mammals were identified and their genes isolated from cDNA. The proteins constituting the larger subunit of retromer were expressed recombinantly and antibodies prepared against each of the respective GST-fusion proteins. With these antibodies the existence of AtVps35, AtVps26 and AtVps29 in plant cells were demonstrated both in soluble and membrane bound forms. With these antibodies it was possible to demonstrate the presence of a retromer-like protein complex in salt-extracts prepared from Arabidopsis microsomes and to determine its size by gel filtration. This complex coequilibrates in a sucrose density gradient with prevacuolar and with high-density sedimenting membranes. Immunogold negative staining of the latter showed positive labelling of 90-nm-diameter coated microvesicles that are possibly retromer-coated vesicles. Confocal laser scanning immunofluorescence microscopy performed on tobacco BY 2 cells revealed high degrees of colabelling between all retromer antibodies and the PVC-markers PEP12 and VSRAt-1. The presence of plant retromer at the surface of MVBs was demonstrated in the electron microscope by immunogold labeling of sections obtained from high-pressure frozen and freeze-substituted BY 2 cells. Treatment of BY-2 cells with wortmannin led to swelling of the PVC and a separation of the VPS35 and VSR signals. By immunoprecipitation, an interaction of AtVps35 with the vacuolar sorting receptor VSRAt-1 was detected. It was therefore possible to infer from this experiment that retromer-coated vesicles are involved in retrograde protein trafficking from the PVC to the Golgi. This supports the notion that retrograde transport of vacuolar sorting receptors from the PVC is both selective and retromer-mediated. The results of this work therefore support the concept that the transport machinery to the lytic compartment and the recycling of receptors between endosomal or prevacuolar compartments and the TGN is well conserved among eukaryotes.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Robinson, Prof. David G.
Date of thesis defense: 27. April 2007
Date Deposited: 10. May 2007 15:13
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteintransport, Endosom, Golgi-Apparat, Coated vesicle
Uncontrolled Keywords: Retromer , Vakuolärer SortierungsrezeptorRetromer , Vacuolar Sorting Receptor
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