German Title: Die Signalleitung durch den Erythropoetin-Rezeptor wird durch die hohe Packungsdichte der Transmembrandomäne gefördert und durch eine schnelle Rezeptorinternalisierung reguliert

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Abstract

The fine-tuned balance of self-renewal and rapid adaptation in the hematopoietic system are regulated by cytokines. Cytokine receptors are single membrane-spanning proteins that lack intrinsic enzymatic activity and therefore associate with cytoplasmic tyrosine kinases to initiate signal transduction. The key regulator of erythropoiesis is the erythropoietin receptor (EpoR) that shows low cell surface expression and a partially punctuated subcellular localization. Efficient signaling through the preformed homodimeric receptor is facilitated by self-assembly of the transmembrane (TM) domain. Moreover, the sensitivity of signal transduction depends on the extent of receptor accessible for ligand binding and therefore on the trafficking kinetics for transport to and removal from the plasma membrane. By using single-particle tracking, we demonstrated that trafficking of EpoR-containing vesicle-like structures critically relies on active transport along microtubules, leading to enhanced diffusion in the crowded cytoplasm. A TM domain mutant EpoR-T242N was identified that is not detected in punctuated structures. Surprisingly, EpoR-T242N showed cell surface expression as well as maturation and internalization kinetics comparable to wild-type EpoR, but deficiencies in selective signal amplification of downstream signal pathways. All-atom molecular modeling revealed an increased interhelical distance for the EpoR-T242N TM dimer, suggesting a link between packing density of the TM domain and the formation of visible dynamic higher oligomeric structures as well as efficient activation of signaling. To gain insight into the dynamic behavior of receptor turnover and internalization, a systems biology approach was applied. Upon ligand stimulation, the EpoR was rapidly internalized, but remarkably the amount of ligand-bound receptor at the plasma membrane recovered after approximately four hours. Nevertheless, activation of EpoR was restrained upon prolonged stimulation, revealing that internalization does not mediate long-term attenuation of receptor signaling. Dynamic modeling of receptor endocytosis showed that the majority of internalized ligand was recycled to the medium, whereas only 20% were degraded. This mechanism permits EpoR signaling without depletion of the ligand in the extracellular environment, being especially important for low physiological Epo levels in the hematopoietic stem cell niche. Sensitivity analysis uncovered the parameters receptor turnover, kon for ligand binding, and internalization as critical for generating the steep rise and rapid decline in forming Epo-EpoR complexes, whereas the dissociation constant KD commonly used to characterize Epo derivatives for clinical applications had essentially no influence. In conclusion we propose two mechanisms regulating signal activation at the receptor level. Rapid internalization of ligand-bound EpoR shapes the kinetics of signaling-competent ligand-receptor complex formation. Dynamic oligomerization beyond the dimer may permit control of selective amplification of downstream signal pathways and biological responses.

Translation of abstract (German)

Zytokine regulieren die fein abgestimmte Balance zwischen Selbsterneuerung und schneller Adaption des hämatopoetischen Systems. Zytokinrezeptoren haben eine einzelne Trans¬membrandomäne (TM) und weisen keine eigene enzymatische Aktivität auf, so dass sie zur Initiation der Signalleitung mit zytoplasmatischen Tyrosinkinasen assoziieren. Der zentrale Regulator der Erythropoese ist der Erythropoetin-Rezeptor (EpoR), der in nur geringen Men¬gen an der Zelloberfläche exprimiert wird und teilweise in intrazellulären punktierten Struktu¬ren lokalisiert. Eine effiziente Signalleitung durch das vorgeformte EpoR-Homodimer wird durch die Selbstinteraktion der TM-Domäne unterstützt. Des Weiteren hängt die Sensitivität der Signalleitung von der Zugänglichkeit des Rezeptors zum Liganden und daher von sei¬nem Transport zu und von der Plasmamembran ab. Mittels Partikel-Tracking konnten wir zeigen, dass der Transport von EpoR-positiven vesikulä¬ren Strukturen von aktivem Transport entlang von Mikrotubuli abhängig ist, was zu ei¬ner erhöhten Diffusion im crowded Zytoplasma führt. Eine TM-Mutante EpoR-T242N war nicht in punktierten Strukturen nachzuweisen. Überraschenderweise zeigte EpoR-T242N eine mit dem Wildtyp-EpoR vergleichbare Zelloberflächenexpression sowie Reifungs- und Internalisierungskinetiken, wies aber Defizite in der selektiven Amplifikation von Signalkaskaden auf. Die molekulare Modellierung der TM-Dimere des EpoR-T242N zeigte einen erhöhten interhelikalen Abstand, was einen Zusammenhang zwischen einer dichtgepackten Struktur der TM und der Bildung von detektierbaren, dynamischen höher oligomeren Strukturen sowie einer effizienten Signalaktivierung impliziert. Ein systembiologischer Ansatz wurde zur Untersuchung des dynamischen Verhaltens von Rezeptorumsatz und Internalisierung angewandt. Nach Ligandenstimulation wurde der EpoR schnell internalisiert, wobei die Menge an ligandengebundenem Rezeptor an der Plasmamembran bemerkenswerterweise nach ungefähr vier Stunden regeneriert war. Da die Aktivierung des EpoR nach anhaltender Stimulation trotz Präsenz des Rezeptors an der Zelloberfläche unterdrückt war, ist die Rezeptorinternalisierung nicht für die langfristige Abschwächung der Signalleitung verantwortlich. Die dynamische Modellierung der Rezeptorendozytose zeigte, dass der Großteil des internalisierten Liganden in das Medium rücktransportiert wurde, während nur 20% intrazellulär degradiert wurden. Dieser Mechanismus erlaubt eine Aktivierung des EpoR, ohne den Liganden im extrazellulären Medium aufzubrauchen, was vor allem bei den niedrigen physiologischen Epo-Konzentrationen der hämatopoetische Stammzellnische bedeutend ist. Eine Sensitivitätsanalyse identifizierte die Parameter Rezeptorumsatz, die Assoziationsrate kon des Liganden sowie die Internalisierung als entscheidend, um den steilen Anstieg und die schnelle Abnahme bei der Bildung von Liganden-Rezeptor-Komplexen zu formen. Die Dissoziationskonstante KD, die im Allgemeinen zur Charakterisierung von Epo-Derivaten für klinische Anwendungen herangezogen wird, hatte dagegen keinen Einfluss auf diese Kinetik. Zusammenfassend schlagen wir zwei Mechanismen vor, die die Signalleitung auf Rezeptorebene regulieren. Die schnelle Internalisierung von ligandengebundenem EpoR formt die Kinetik der Bildung von signalkompetenten Ligand-Rezeptor-Komplexen. Die dynamische Bildung von höher oligomeren Rezeptorenstrukturen erlaubt die selektive Amplifikation von Signalwegen und beeinflusst so biologische Entscheidungen in Zellen.