Directly to content
  1. Publishing |
  2. Search |
  3. Browse |
  4. Recent items rss |
  5. Open Access |
  6. Jur. Issues |
  7. DeutschClear Cookie - decide language by browser settings

The generation and characterisation of mice with conditional knock-out of the NMDA receptor subunit NR2B

Doganci, Beril

German Title: Generierung und Charakterisierung vom Mäusen mit konditionalem Knock-out der NR2B-Untereinheit des NMDA-Receptors

[img]
Preview
PDF, English
Download (2214Kb) | Terms of use

Citation of documents: Please do not cite the URL that is displayed in your browser location input, instead use the persistent URL or the URN below, as we can guarantee their long-time accessibility.

Abstract

The N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors belong to the family of ionotropic glutamate receptors. They play a critical role in neuronal pattern formation during development and in synaptic plasticity as molecular coincidence detectors. NMDA receptor is a tetrameric protein complex comprised of two obligatory NR1 subunits and two identical or different NR2 subunits, of which four types exist named NR2A-D. In rodents and other mammals, NR1 and NR2B are expressed in the entire central nervous system, already at embryonic stages, whereas NR2A expression starts and increases only postnatally to coexist with NR2B in the adult brain. Mice lacking the NR1 subunit or lacking the NR2B subunit die at birth, whereas mice lacking NR2A are viable. Both NR2A and NR2B containing NMDA receptors are implicated in synaptic plasticity, learning and memory formation but their distinctive functions are unknown. The NR2B subunit received a lot of attention because mice genetically altered to overexpress NR2B showed improved spatial reference memory and enhanced LTP. The lethality of the general NR2B knock-out gives rise to the necessity of a conditional knock-out, by which deleterious effects due to lack of NR2B during embryogenesis are prevented, and the physiological function of NR2B can be elucidated in the postnatal brain. For this purpose, a DNA construct for homologous recombination in embryonic stem (ES) cells was generated with NR2B allele exon 6 flanked by loxP sequences. This exon encodes the region preceding the first transmembrane domain of the NR2B subunit. As a selection marker, a neomycin resistance gene flanked by frt sites was introduced in intron 6. The selection marker was subsequently removed by flp recombinase from the targeted NR2B allele, and the ES cells were used for blastocyst injection to derive NR2B2lox mice. NR2B2lox mice were bred with TgCre4 mice, selectively expressing Cre recombinase in forebrain principal neurons, to generate mice heterozygous for the transgene TgCre4 and homozygous for the conditional NR2B allele (NR2B2lox/2lox). In these mice (NR2B(delta)Fb), postnatal forebrain principal neurons should lack NMDA receptors containing the NR2B subtype. Deletion of NR2B in NR2B(delta)Fb mice was revealed by electrophysiological measurements. In parallel, in this study, also lentiviral mediated gene delivery was used in vivo for Cre/loxP mediated DNA recombination. Recombinant lentivirus encoding Cre recombinase and the GFP protein under the control of the alpha-CaMKII promoter was delivered stereotactically to the hippocampal CA1 region of NR2B2lox/2lox mice at P20. Lack of NR2B was assessed by electrophysiological measurements of synaptic and whole-cell NMDA currents, using NR2B specific antagonists. Recordings from CA1 neurons revealed reduced NMDA currents, lack of sensitivity to ifenprodil, a selective blocker of NR2B containing NMDA receptors, and faster than wild type deactivation kinetics of NMDA mediated currents, indicating the effective loss of the NR2B-type NMDA receptors. Frequency and AMPA component of miniature EPSCs were unaltered whereas the NMDA component was reduced. Moreover an impairment of cellular LTP could be shown. Western blot analysis from hippocampal homogenates of NR2B(delta)Fb mice showed a 70% reduction of the NR2B subunit levels, and no significant change in the expression levels of NR2A, and of the AMPA receptor subunits GluR-A and GluR-B. Collectively, these studies describe a conditional mouse model for elucidating the particular physiological functions of the NR2B type of NMDA receptors in the adult forebrain.

Translation of abstract (German)

N-Methyl-D-Aspartat(NMDA)-Rezeptoren gehören zur Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Musterbildung während der Entwicklung sowie bei der synaptischen Plastizität als molekulare Koinzidenzdetektoren. NMDA-Rezeptoren sind tetramere Proteinkomlexe, die aus zwei obligatorischen NR1-Untereinheiten und zwei identischen oder verschiedenen NR2-Untereinheiten, von denen es vier Typen (NR2A-D) gibt, gebildet werden. In Nagern und anderen Säugetieren werden NR1 und NR2B im gesamten zentralen Nervensystem bereits im Embryonalstadium exprimiert, die Expression von NR2A beginnt dagegen erst nach der Geburt und nimmt während der ersten postnatalen Wochen zu, so dass NR2B und NR2A im erwachsenen Hirn gemeinsam vorkommen. Mäuse, denen NR1 oder NR2B fehlen, sterben kurz nach der Geburt, während Mäuse ohne NR2A lebensfähig sind. Sowohl NR2A- als auch NR2B-enthaltende NMDA-Rezeptoren wirken mit bei synaptischer Plastizität, Lernen und Gedächtnisbildung. Die NR2B-Untereinheit erhielt starke Aufmerksamkeit, da Mäuse mit Überexpression von NR2B verbessertes räumliches Referenzzgedächtnis und Verstärkung von LTP zeigten. Die Letalität des generellen NR2B Knock-out erfordert einen konditionellen Knock-out, durch den die nachteiligen Effekte infolge des Fehlens von NR2B während der Embryogenese verhindert werden, und mit dem die physiologische Funktion von NR2B im postnatalen Gehirn aufgeklärt werden kann. Zu diesem Zweck wurde ein DNA-Konstrukt für die homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) hergestellt, in dem Exon 6 durch loxP-Sequenzen flankiert wird. Dieses Exon kodiert für die Region N-terminal vor der ersten Transmembrandomäne der NR2B-Untereinheit. Als Selektionsmarker wurde ein von frt-Sequenzen flankiertes Neomycin-Resistenzgen in Intron 6 eingeführt. Der Selektionsmarker wurde anschließend durch Flp-Rekombinase aus dem veränderten NR2B-Allel entfernt und die ES-Zellen wurden in Blastozysten injiziert, um NR2B2lox Mäuse zu erhalten. NR2B2lox Mäuse wurden mit TgCre4-Mäusen verpaart, welche Cre-Recombinase ausschliesslich in Prinzipalzellen des Vorderhirns exprimieren, um NR2B(delta)Fb-Mäuse zu erhalten, die heterozygot für das Transgen TgCre4 und homozygot für das konditionelle NR2B-Allel (NR2B2lox/2lox) sind. In NR2B(delta)Fb-Mäusen sollten postnatal in Prinzipalzellen des Vorderhirns NR2B-enthaltende NMDA-Rezeptoren fehlen. Die Deletion von NR2B in NR2B(delta)Fb-Mäusen wurde durch elektrophysiologische Messungen bestätigt. Parallel dazu wurden auch Versuche unternommen, bei denen in vivo lentiviral induzierte Cre-Expression für die DNA-Rekombination genutzt wurde. Rekombinante Lentiviren, die Cre-Recombinase und GFP unter der Kontrolle des alpha-CaMKII-Promoters exprimieren, wurden stereotaktisch in die hippocampale CA1-Region von homozygoten NR2B2lox/2lox Mäusen am Tag P20 injiziert. Das Fehlen von NR2B wurde durch elektrophysiologische Messungen von synaptischen und Ganzzell-Strömen untersucht, wobei NR2B-spezifische Antagonisten eingesetzt wurden. Messungen an CA1-Neuronen zeigten reduzierte NMDA-Ströme, das Fehlen von Ifenprodil-Sensitivität sowie Deaktivierungskinetiken von NMDA-vermittelten Strömen, die schneller als in Wildtyp-Mäusen waren, alles Hinweise auf einen effektiven Ausfall von NMDA-Rezeptoren vom NR2B-Typ. Frequenz und AMPA-Komponente von Miniatur-EPSC's blieben unverändert, die NMDA-Komponente war dagegen reduziert. Darüberhinaus konnte eine Verminderung des zellulären LTP gezeigt werden. Die Western-Blot Analyse von hippocampalen Homogenaten aus NR2B(delta)Fb-Mäusen ergab eine 70%ige Reduktion der NR2B-Untereinheit und keine signifikante Änderung in der Expressionshöhe von NR2A sowie der AMPA-Rezeptoruntereinheiten GluR-A und GluR-B. Zusammenfassend beschreiben diese Studien ein konditionelles Mausmodell, um die speziellen physiologischen Funktionen des NR2B-Typs der NMDA-Rezeptoren im erwachsenen Vorderhirn aufzuklären.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Seeburg, Prof. Peter
Date of thesis defense: 28. July 2006
Date Deposited: 31. May 2007 09:25
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hippocampus
Uncontrolled Keywords: Glutamatrezeptoren , synaptische Plastizität , Lernen und Gedächtnisbildung , Cre-recombinase , knock-out , NR2B , LTPGlutamate receptors , synaptic plasticity , learning and memory , Cre-recombinase , knock-out , NR2B , LTP
About | FAQ | Contact | Imprint |
OA-LogoLogo der Open-Archives-Initiative