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Interaktionen der molekularen Lipidumgebung mit dem Alzheimer Amyloid-Vorläuferprotein

Schmitt, Oliver

English Title: Probing the molecular lipid-environment of the amyloid precursor protein (APP)

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Abstract

Die Alzheimer Krankheit („Alzheimer’s Disease“ = AD) ist eine weitverbreitete neurodegenerative Erkrankung des Nervensystems. Von zentraler Bedeutung für die Pathogenese ist eine veränderte proteolytische Freisetzung des Amyloid-beta Peptids (Abeta) aus dem Amyloid-Vorläuferprotein („Amyloid Precursor Protein“ = APP), da die Aggregation von Abeta nach gängiger Meinung eine neuropathologische Kaskade auslöst. APP wird in der Zelle durch verschiedene als Sekretasen bezeichnete Proteasen prozessiert, wobei zwei proteolytische Szenarien möglich sind. Im nicht amyloidogenen Abbau wird APP innerhalb der Abeta-Sequenz von der beta-Sekretase geschnitten, wodurch die Entstehung des pathologischen Abeta Peptids verhindert wird. Die amyloidogene Prozessierung wird initiiert durch die Aktivität einer beta-Sekretase, die APP aminoterminal (N-terminal) von Abeta spaltet. Die Entscheidung, über welchen der beiden Proteolysewege APP abgebaut wird, wird maßgeblich durch Lipide reguliert. In beiden Prozessierungsrouten wird jeweils eine große N-terminale Domäne ins Lumen bzw. extrazellulär freigesetzt, während das resultierende carboxyterminale (C-terminale) Fragment membranverankert bleibt. Diese C-terminalen Fragmente sind Substrate für eine sogenannte beta-Sekretase. Im Falle des amyloidogenen Abbaus wird das 99 Aminosäuren (AS) lange, membrangebundene Fragment (C99) C-terminal von Abeta geschnitten und somit das Peptid aus der Membran freisetzt. Diese zweite Proteolyse ist heterogen und resultiert hauptsächlich in Abeta-Spezies mit einer Länge von entweder 40 oder 42 AS. Die APP Mutationen London und Florida führen zu einem erhöhten Abeta 42/Abeta 40 Verhältnis und verursachen eine besonders schwere Form von AD, da die Entstehung von Abeta 42, das stärker zur Aggregation neigt, der initiierende Schritt in der AD Pathogenese zu sein scheint. Die molekulare und zelluläre Basis des APP Transports, der Prozessierung und der Abeta Produktion sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Komponenten, die mit C99 innerhalb der Lipidmembran interagieren. In einem in vitro System mit an spezifischen Positionen photoaktivierbarem, in Mikrosomenmembranen inseriertem C99, konnte bei UV-Bestrahlung eine Quervernetzung mit Phosphoglycerolipiden beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde in C99-exprimierenden N2a Zellen, die mit photolabilen und radioaktiven Lipidvorstufen markiert wurden, in vivo verifiziert. So interagierten C99 Moleküle mit Lipiden, die aus einem photolabilen Derivat der Stearinsäure aufgebaut waren, nicht aber mit radioaktiven, photoaktivierbaren Derivaten von Phosphatidylcholin (PC), Sphingolipiden oder Cholesterin. Während endogenes APP in Präparationen von Detergens resistenten Membranbereichen (DRMs) zu einem geringen Prozentsatz mit DRMs assoziiert vorliegt, konnte überexprimiertes C99 nicht in DRMs nachgewiesen werden. Die subzelluläre Lokalisation von C99 ist in der Literatur sehr umstritten. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Fusionsproteine aus YFP („yellow fluorescent protein“) oder CFP („cyan fluorescent protein“) mit C99 in Vero Zellen im Golgi-Apparat lokalisiert sind. C99 Wildtyp und C99 mit den pathogenen Mutationen London und Florida verhielten sich in Crosslink-Experimenten, der subzellulären Verteilung und in Präparationen von DRMs identisch. In einem Markierungsexperiment von SH-SY5Y-Zellen mit photolabilen Lipidvorläufer-Molekülen wurde von den fünf Komponenten der gamma-Sekretase nur glykosyliertes Nicastrin (Nct) mit [3H]-photo-Cholesterin markiert, während mit nichtglykosyliertem Nct oder den weiteren gamma-Sekretase Untereinheiten keine Interaktion mit Cholesterin detektiert werden konnte. Reifes Nct wurde zusammen mit einem weiteren, noch nicht identifizierten Protein, mit [3H]-photo-Sphingosin markiert. Demgegenüber war die Interaktion von Nct mit [3H]-photo-Phosphatidylcholin war nur sehr schwach und zeigte keine Präferenz für reifes oder unreifes Nct. Demnach scheint mindestens eine Komponente der gamma-Sekretase eine hohe Affinität für Raft-Lipide zu haben, während C99 offensichtlich hauptsächlich außerhalb von DRMs existiert. Geringe Mengen von C99, das mit DRMs assoziiert vorliegt, könnten zur Produktion von Abeta 42 führen, was aber noch genauer untersucht werden muss.

Translation of abstract (English)

Alzheimer’s Disease (AD) is a widespread neurodegenerative disorder of the nervous system. An essential event in the pathogenesis of AD is a change in the proteolysis of amyloid precursor protein (APP) to produce amyloid-beta peptide (Abeta), aggregation of which is generally believed to initiate a neurotoxic cascade. APP is processed in the cell by several proteases, called secretases, which are partially lipid-regulated. One of at least two possible APP cleavage pathways generates the membrane-bound C-terminal fragment C99, which is a substrate for beta-secretase and leads to Abeta production. This second cleavage step is heterogeneous, mainly resulting in Abeta species of either 40 or 42 amino acids. APP London and Florida mutations show an increase in the Abeta 42/Abeta 40 ratio and cause a very severe form of AD. The generation of Abeta 42, which is prone to aggregation, seems to be an initial step in AD pathogenesis. However, the molecular and cellular basis of APP trafficking and processing, and Abeta generation are still not fully understood. It was the aim of this work to elucidate components directly interacting with C99 in the membrane bilayer. To this end a photoactivatable amino acid was introduced at various defined positions within different C99 species in an in vitro site-directed photocrosslinking approach. We found a specific interaction of C99 with a phosphoglycerolipid of the membrane. This interaction was verified in an in vivo labeling experiment with photolabile lipid precursors and N2a cells expressing C99. C99 crosslinked to a phosphoglycerolipid generated from a photoactivatable derivative of stearic acid, whereas no C99 labeling with the radioactive photolabile derivatives of phosphatidylcholine, sphingosine or cholesterol could be detected. While endogeneous APP was associated to some degree with detergent resistant membranes (DRMs), overexpressed C99 was not detectable in DRMs. In the literature the subcellular localization of C99 is still highly debated. The data in this work demonstrate that fusion proteins of YFP (yellow fluorescent protein) or CFP (cyan fluorescent protein) with C99 located to the Golgi apparatus of Vero cells. C99 wild type and C99 with the pathogenic mutations London and Florida showed no differences in crosslink experiments, subcellular localization or in preparations of DRMs. In a labeling experiment of SH-SY5Y cells with the photolabile lipid precursors, only one of five components of the gamma-secretase was labeled with [3H]-photo-cholesterol. This subunit was the mature highly glycosylated form of nicastrin (Nct), whereas immature Nct and other components of the secretase were not crosslinked to the photolabile lipid. Along with a still unidentified protein, mature Nct was also labeled with [3H]-photo-sphingosine. On the other hand, the interaction of Nct with [3H]-photo-phosphatidylcholine was only weak and showed no preference for mature or immature Nct. Therefore at least one gamma-secretase component seems to possess a high affinity for raft lipids, whereas C99 exists predominantly outside of rafts. Small amounts of C99 associated with DRMs could lead to Abeta 42 production, but this has to be investigated in more detail.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof Felix T.
Date of thesis defense: 3 July 2007
Date Deposited: 25 Jul 2007 11:04
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Alzheimer-Krankheit
Uncontrolled Keywords: Lipid-Protein Interaktionen , Lipid Rafts , gamma-SekretaseAlzheimer's Disease , lipid-protein interactions , lipid-raft, gamma-secretase
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