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Screening for nuclear reprogramming factors and analysis of DNA demethylation during in vitro myoblasts dfferentiation

Swaminathan, Suresh Kumar

German Title: Identifizierung von Nucleären reprogramierenden Faktoren und DNA-Demethylierungsanalyse während der in vitro Differenzierung von Myoblasten

PDF, English (Thesis)
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The primary objective of this thesis was to identify nuclear reprogramming factors that would convert somatic cells back into pluripotency. Two broad screening strategies using the expression of stem cell marker Oct4 as a molecular read out were employed. i) Expression screening of Xenopus egg cDNA library: Xenopus eggs are totipotent as they have the capacity to give rise to whole organism. Xenopus egg cDNA libraries were screened by overexpression in various cell lines to isolate the genes that would upregulate the Oct4 expression. ii) Chemical Genomics screen: A library of about 3000 small molecules available at the DKFZ-EMBL chemical genomics core facility was screened in a HEK293 stable cell line that harbours a luciferase reporter under the control of the Oct4 promoter and primary fibroblasts obtained from the mouse harbouring a GFP reporter under the control of the Oct4 promoter. I could not isolate any gene or small molecule that could specifically upregulate the Oct4 expression by the above mentioned screens. The second objective of this thesis concerns epigenetic changes during cellular differentiation. Several reports have indicated that DNA demethylation accompanies cellular differentiation. As a model case when C2C12 myoblasts were induced to differentiate into myotubes, the promoter of the muscle specific transcription factor Myogenin gene is demethylated and thereby facilitating its expression. Our group recently showed that Gadd45alpha mediates active DNA demethylation by a nucleotide excision repair mechanism. I tested if Gadd45 may mediate the demethylation observed during the C2C12 differentiation by knocking down the different isoforms of Gadd45. Gadd45beta knockdown blocked the Myogenin promoter demethylation as analysed by MS-PCR and COBRA assays. Moreover, the Myogenin expression was significantly reduced. In conclusion, Gadd45 is indeed required to relieve gene silencing during the differentiation of myoblasts into myotubes.

Translation of abstract (German)

Das grundlegende Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von nukleären, reprogrammierenden Faktoren mit der Fähigkeit, somatische Zellen in pluripotente Zellen zu konvertieren. Hierfür wurden zwei umfassende Strategien angewandt, in denen die Expression des Stammzellmarkers Oct4 als molekularer Readout verwendet wurde. i) Expressionsanalysen unter Verwendung von Xenopus cDNA Bibiliotheken: Xenopus Eier sind totipotent, d.h. sie können Ausgangspunkt für einen kompletten Organismus sein. Eine cDNA Bibiliothek aus Xenopus Eiern wurde in verschiedenen Zelllinien überexprimiert, um Gene zu isolieren, die Oct4 Expression induzieren. ii) Chemische genomweite Analysen: Eine Bibliothek von 3000 kleinen chemischen Verbindungen der „DKFZ-EMBL chemical genomics core facility“ wurde für die Analyse in einer HEK293 stabilen Zelllinie verwendet, die ein Luziferase Reporterplasmid unter der Kontrolle des Oct4 Promotors trägt. Die Bibiolothek wurde ebenfalls in primären Fibroblasten einer transgenen Maus getestet, die einen GFP Reporter unter der Kontrolle des Oct4 Promotors tragen. Ich konnte in den durchgeführten Screens kein Gen oder Molekül isolieren, welches spezifisch die Oct4 Expression hochreguliert. Die zweite Fragestellung dieser Arbeit befasst sich mit epigenetischen Veränderungen während der zellulären Differenzierung. Mehrere Untersuchungen belegen, dass Differenzierung mit DNA Demethylierung einhergeht. So wird zum Beispiel während der Differenzierung von C2C12 Myoblasten zu Myotuben der Promotor eines Muskel spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin demethyliert und somit dessen Transkription induziert. Kürzlich wurde in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass Gadd45alpha aktive DNA Demethylierung unter Einbeziehung von Nukleotid-Entfernungsreparatur vermittelt. Ich habe getestet, ob Gadd45 ebenfalls ein Schlüsselrolle bei der Demethylierung während der C2C12 Differenzierung spielt, indem ich die Expression verschiedener Gadd45 Isoformen dezimiert habe. MS-PCR und COBRA Analysen zeigen, dass Gadd45beta Knockdown die Demethylierung des Myogenin Promotors blockiert. Darüberhinaus war die Myogenin Expression signifikant reduziert. Folglich ist Gadd45 in der Tat notwendig, Gen-Stilllegung während der Differenzierung von Myoblasten zu Myotuben aufzuheben.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Niehrs, Prof Christof
Date of thesis defense: 12 July 2007
Date Deposited: 09 Aug 2007 11:24
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Zellkultur, Pluripotenz, Demethylierung, Differenzierung
Uncontrolled Keywords: Cell culture , Pluripotency , demethylation , Differentiation
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