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The 3D Architecture of Interphase Microtubule Cytoskeleton and Functions of Microtubule Plus End Tracking Proteins in Fission Yeast

Höög, Johanna

German Title: Die dreidimensionale Architektur des interphasischen Zytoskeletts und die Funktionen von Mikrotubulus Plus-Ende folgenden Proteinen in der Spalthefe

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Abstract

The microtubule (MT) cytoskeleton is important for establishing polar growth in the rod-shaped fission yeast (Schizosaccharomyces pombe). In these cells, MTs form an architectural scaffold of the cell by positioning organelles such as the nucleus and mitochondria. Interphase MTs are arranged in bundles along the cell’s long axis. The filaments start growing in the cell’s middle in a zone of anti-parallel overlap, from which the more dynamic plus ends of MTs extend towards both cell ends. After cell division the cell grows exclusively from the old end (away from the septum), where the growth machinery is still present from the mother cell. New end take off (NETO) occurs after about a third of the way through the cell cycle, when F-actin has moved into the new end. From this point onwards maintenance of polar growth is MT independent and occurs at both cell ends. Guidance of the microtubules to the cell ends is performed by plus end tracking proteins (+TIPs), such as Tea1 and Tip1 (Clip-170). Tea1 is a landmark protein localizing to the cell ends. Tip1 is an anti-catastrophe factor that prevents MT depolymerization before the filament has reached the cell end. The delivery of Tip1 to MT ends is motors dependent and another +TIP, Mal3, anchors it at the MT end. Mal3 (EB1) stabilizes MTs, possibly by fortify its seem. Here we describe a large-scale, electron tomography investigation of wild-type (WT) S. pombe cells, including the first 3D reconstruction of a complete eukaryotic cell volume. Sufficient resolution to show both how many MTs there are in a bundle and their detailed architecture was achieved. Most cytoplasmic MTs are open at one end and capped at the other, providing evidence about their polarity. Electron-dense bridges between the MTs themselves and between MTs and the nuclear envelope were frequently observed. Finally, we have investigated structure/function relationships between MTs and both mitochondria and vesicles. Using the same approach, we then analyzed the bundle architechture in tip1Δ and mal3Δ mutants. MTs were half the length of WT in mal3Δ and a quarter the length of WT in tip1Δ. Further, there were less than half as many MTs in a bundle in tip1Δ then in WT. In contrast, mal3Δ bundles no difference in the amount of filaments in a bundle. However, structural differences of the MT lattice were observed in both mutants. The interaction between MTs and the spindle pole body was altered in both strains. Our analysis shows that electron tomography of well-preserved cells is ideally suited for describing fine ultrastructural details that were not visible with previous techniques.

Translation of abstract (German)

Die Mikrotubuli ueben bei der Etablierung des polaren Wachstums der staebchenfoermigen Spalthefe (Schizosaccharmomyces pombe) eine wichtige Funktion aus. Durch die Positionierung der Organellen wie Zellkern und Mitochondrien bilden sie außerdem ein architektonisches Geruest für die innere Organisation der Zelle. Sie wachsen durch Polymerisierung von Tubulinuntereinheiten an ihren Plusenden in Richtung beider Zellpole. Die Minus-Enden der Filamente befinden sich im Zentrum der Zelle in einer Zone antiparalleler Ueberlappung. Nach der Mitose waechst die neue Zelle ausschließlich an dem bereits existierenden Ende (gegenueber des Septums), an dem die Wachstumsmaschinerie der Mutterzelle noch vorhanden ist. Nach ungefaehr einem Drittel des Zellzyklusses, nachdem das neue Ende durch Rekrutierung von F-Aktin stabilisiert worden ist, findet der sogenannte ’New End Take Off’ (NETO) statt. Ab diesem Zeitpunkt ist die Aufrechterhaltung des polaren Wachstums unabhaengig von den MT und tritt an beiden Zellenden auf. Die Dirigierung der MT zu den Zellenden wird von den ’plus end tracking proteins’ (+TIPs), wie zum Beispiel Tea1 and Tip1 (Clip-170), ausgefuehrt. Tea1 ist ein Markierungsprotein, welches an beiden Zellenden lokalisiert ist. Tip1 verhindert Depolymerisierung der MT bis diese das Zellende erreicht haben. Diese Faktor wird von Motormolekuelen zu MT-Enden transportiert und dort von einem anderen +TIP Protein, Mal3, verankert. Mal3 (EB1) stabiliziert die MT, warscheinlich durch Verstaerkung des Saums. Hier beschreiben wir die Untersuchung von Wildtyp (WT) S. pombe Zellen mittels Elektronentomographie in grossem Maßstab einschließlich der ersten 3D Rekonstruktion eines vollstaendigen eukaryotischen Zellvolumens. Aufgrund der hohen Aufloesung konnten sowohl die Anzahl der MT pro Buendel als auch ihre detaillierte Architektur gezeigt werden. Die meisten zytoplasmischen MT lagen an einem Ende offen und am anderen geschlossen vor, was Rueckschluesse auf ihre Polaritaet zuließ. Ausserdem wurden haeufig elektronendichte Bruecken zwischen den MT selbst sowie zwischen MT und der Huelle des Zellkerns beobachtet. Schließlich konnten Einblicke in die Struktur- und Funktionsbeziehungen von MT zu Mitochondrien und Vesikeln gewonnen werden. Im naechsten Schritt haben wir in derselben Vorgehensweise die Buendelarchitektur von tip1Δ und mal3Δ Mutanten analysiert. Die MT waren im Vergleich zum WT in mal3Δ Zellen um die Haelfte, in tip1Δ sogar um drei Viertel verkuerzt. Ausserdem bestand in tip1Δ ein Buendel aus weniger als halb so vielen MT als im WT. Im Gegensatz hierzu wurde in mal3Δ kein Unterschied bezueglich der Zahl an Filamenten pro Bündel festgestellt. Allerdings wurden in beiden Mutanten strukturelle Veraenderungen des MT Gitters beobachtet. Auch die Interaktion zwischen MT und dem Spindelpolkoerper war in beiden Hefestaemmen gestoert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Elektronentomographie von gut erhaltenen Zellen eine ideale Methode darstellt, um ultrastrukturelle Details zu erforschen, welche mittels frueherer Techniken nicht sichtbar waren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Brunner, Damian PhD
Date of thesis defense: 21 May 2007
Date Deposited: 28 Aug 2007 10:46
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Cytologie, Zellskelett, Mikrotubulus, Hefeartige Pilze, Elektronenmikroskopie
Uncontrolled Keywords: microtubules , cell polarity , electron tomography , fission yeast
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