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Untersuchung zur Expression, Spezifität und Regulation der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren RhoGEF10 und RhoGEF17

Mohl, Marion

English Title: Characterisation of the expression, specificity and regulation of the guanine nucleotide exchange factors RhoGEF10 and RhoGEF17

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Abstract

Die koordinierte Regulation von Rho-GTPasen ist entscheidend für die Funktion von vaskulärem Gewebe. Rho-GTPasen kontrollieren hierbei als zentrale Mediatoren Prozesse wie Proliferation, Migration und Kontraktion sowohl glattmuskulärer als auch endothelialer Zellen. Bis heute ist jedoch nur wenig über die unmittelbar beteiligten akzessorischen Proteine und Signalübertragungswege bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, in diesem Kontext die Rolle der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren RhoGEF10 und RhoGEF17 zu charakterisieren sowie deren übergeordnete Regulation näher zu untersuchen. Dazu wurden unterschiedliche zelluläre Systeme (permanente Zelllinien (HEK-293 und TSA), isolierte glattmuskuläre Zellen der Rattenaorta (RASMC) und humane Endothelzellen der Umbilikalvene) als Modell verwendet und die Signalübertragung mittels diverser molekularer Werkzeuge (Toxine, bioaktive Substanzen, eukaryote Expressionsvektoren, rekombinante Adenoviren, shRNA-kodierende Adenoviren) beeinflusst. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass RhoGEF10 spezifisch RhoA-C mit einer Präferenz für RhoB aktiviert. Des Weiteren haben immunhistologische Untersuchungen eine vorwiegende Expression von RhoGEF10 im Gefäßendothel ergeben. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt, dass das im Gefäßendothel, vor allem aber in der glatten Muskulatur der Gefäße, exprimierte, RhoA-C spezifische RhoGEF17 durch die cGMP-abhängige Proteinkinase I-α (cGKI- α) spezifisch aktiviert wird. Diese Aktivierung setzt eine direkte Interaktion beider Proteine voraus und beinhaltet eine koordinierte Phosphorylierung von RhoGEF17 sowie möglicherweise von RhoA. Mittels der gezielten Mutagenese und der Generierung von trunkierten Mutanten von RhoGEF17 konnte nachgewiesen werden, dass zwei cGK-spezifische Phosphorylierungsstellen (Serine 43 und 1331) für die Regulation der RhoGEF17-Aktivität entscheidend sind. Darüber hinaus wurde ein positiver Rückkopplungsmechanismus innerhalb des cGKI-α/RhoGEF17/RhoASignalwegs identifiziert, welcher in Abhängigkeit der RhoA-regulierten Kinase ROCK und von Phospho-Serin/Threonin-spezifischen Phosphatasen erfolgt. Zusätzlich zu diesen mechanistischen Untersuchungen ist es gelungen in RASMC durch shRNA-mediierte Depletion von endogenem RhoGEF17 zu zeigen, dass die cGMP-abhängige RhoA-Aktivierung in diesen Zellen tatsächlich von der RhoGEF17-Expression abhängig ist. Da die Fehlregulation der Proliferation, Migration und Kontraktion von vaskulären Zellen z. B. bei der Arteriosklerose und der Hypertonie eine wichtige Rolle spielt, könnten RhoGEF17 und RhoGEF10 somit bei diesen Erkrankungen von pathophysiologischer Bedeutung sein.

Translation of abstract (English)

The coordinated regulation of Rho GTPases is crucial for the function of vascular tissue. Rho GTPases control as central mediators processes like proliferation, migration and contraction both in smooth muscle and endothelial cells. However until now only little is known about the involved accessory proteins and signal transduction pathways. Therefore, the aim of this work was to characterise the role of the guanine nucleotide exchange factors RhoGEF10 and RhoGEF17 and to identify upstream regulatory mechanisms. For this purpose different cellular systems (permanent cell lines (HEK-293 und TSA), isolated rat aortic smooth muscle cells (RASMC) and human umbilical cord endothelial cells) were used as models and the cellular signal transduction was studied using different molecular tools (toxins, bioactive substances, eukaryotic expression vectors, recombinant adenovirus, shRNA-coding adenovirus). In the first part of this work it is shown that RhoGEF10 activates specifically RhoA-C with a preference for RhoB. Immunohistological analyses showed that RhoGEF10 exhibits a predominant expression in the aortic vascular endothelium. In the second part of this work it is demonstrated that the RhoA-C specific RhoGEF17, which is endogenously expressed in the aortic vascular endothelium and more prominent in aortic smooth muscle cells, is activated specifically through the cGMPdependent protein kinase I-α (cGKI-α). This activation requires a direct interaction of both proteins and comprises a coordinated phosphorylation of RhoGEF17 and possibly of RhoA. By site-directed mutagenesis and truncation of RhoGEF17 two cGK-specific phosphorylation sites (serine 43 and 1331) were found to be crucial for the regulation of RhoGEF17 activity. Furthermore a positive feedback mechanism could be identified within the cGKI- α/RhoGEF17/RhoA pathway which is dependent on the RhoA-regulated kinase ROCK and on phosho-serine/threonine-specific phosphatases. Moreover, shRNA mediated depletion of endogenous RhoGEF17 in RASMC, revealed that the cGMP-dependent RhoA activation in these cells is dependent on RhoGEF17 expression. As the dysregulation of proliferation, migration and contraction of vascular cells plays a role for the pathogenesis of arteriosclerosis and hypertension RhoGEF17 and RhoGEF10 could be of pathophysiological relevance in these diseases.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wieland, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 5. November 2007
Date Deposited: 08. Nov 2007 11:00
Date: 2007
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Mannheim > Institut für Exp. u. Klin. Pharmakologie und Toxikologie
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Dbl-Familie , Guaninnukleotid-Austauschaktoren , Rho-Proteine , cGMP-abhängige Proteinkinase , SignaltransduktionDbl family , Guanine nucleotide exchange factors , Rho proteins , cGMP-dependent protein kinase , Signal transduction
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