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Purification and biochemical characterisation of novel MOF-containing NSL complexes

Gebhardt, Philipp

German Title: Reinigung und biochemische Charakterisierung neuer MOF-enthaltender NSL-Komplexe

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Abstract

Every cell of a eukaryotic organism contains the whole genome in a membrane-bound nucleus where the DNA is compacted in highly organized chromatin fibers. The association of DNA with histone proteins allows for efficient packaging of the genetic material. Chromatin is a dynamic polymer that is packed and unwrapped in a highly regulated manner to match the multiple tasks that it encounters during the lifetime of a cell. Regulation of DNA accessibility is achieved by the concerted action of chromatin-associated proteins, such as chromatin remodeling enzymes, variant histone proteins and chromatin modifying enzymes. The latter class of enzymes brings about post-translational modifications of histones. Modifications, such as acetylation, can lead to changes in chromatin structure either directly or by recruiting other effector proteins. A process that is linked to histone acetylation is dosage compensation in the fruit-fly Drosophila melanogaster which is studied as a model system for the regulation of chromatin. The multi-protein complex involved, harbours an enzyme, MOF (males absent on the first), with histone acetyltransferase activity directed towards histone H4 lysine 16. Other proteins that have previously been known to associate with it are the MSL (male specific lethal) proteins. Recent biochemical purification of MOF containing complexes revealed that, in addition to the MSL proteins, a number of novel proteins co-purified with MOF in Drosophila and mammals (Mendjan et al., 2006). During my PhD I was therefore interested to study whether these novel proteins, which we named NSL proteins (non-specific lethal), exist in a complex similar to the MSL proteins in Drosophila and if so, what might be their function. Interestingly, we found that one of the NSL proteins, NSL1 has a very similar domain architecture to MSL-1. A major part of this thesis has therefore been to study the NSL1 protein in detail. Using co-immunoprecipitation as well as in vitro interaction assays, I was able to show that NSL1 indeed interacts directly with MOF. By applying an affinity purification strategy tagging the NSL1 protein, my PhD work has demonstrated that NSL1 co-purifies with other NSL proteins in a complex that is distinct from the MSL complex. I have also been able to show by immunofluoresence microscopy that two components of this complex, NSL1 and MCRS2, co-localise on hundreds of sites on all polytene chromosomes, suggesting that very likely these proteins not only interact biochemically but may also function together in vivo. This part of my work has therefore provided novel insights into the existence of the NSL complex in Drosophila and has showed that MOF associates with two distinct sets of proteins, namely the MSLs and the NSLs. In the second part of my PhD work I studied the overall contribution of MSL and NSL complexes in modulating histone acetylation using quantitative mass spectrometric analysis of endogenous histones from Drosophila cells that were RNAi-depleted of MOF, MSL-1 and NSL1. This work revealed that MOF contributes to a majority of histone H4 K16 acetylation in Drosophila cell lines and that MSL-1 plays an important role in modulating the activity of MOF in vivo. Surprisingly, we did not observe any major changes in histone acetylation levels upon NSL1 depletion in vivo. Interestingly, NSL1 depleted cells displayed cell proliferation and segregation defects. The in vivo function of NSL1 remains elusive. Future work will therefore be required to elucidate the mechanism of action of these novel proteins in Drosophila. The foundations for it were layed by this work.

Translation of abstract (German)

Das Genom im Inneren jeder eukaryotischen Zelle wird von einer Kernmembran umgeben. Die darin eingeschlossene DNA ist stark komprimiert und in hochkomplexen Chromatinfasern organisiert. Die Assoziation der DNA mit Histon-Proteinen erlaubt eine effiziente Verpackung des genetischen Materials. Das Chromatin ist ein dynamisches Polymer, welches sich in regulierter Weise kondensiert und dekondensiert, um den vielfältigen zellulären Aufgaben zu genügen. Die Regulierung des Zugangs zur DNA wird durch die konzertierte Aktion Chromatin-assoziierter Proteine, wie ‚Chromatin-remodeler’-Enzymen, Histon-Varianten und Chromatin-modifizierender Enzyme erreicht. Die zuletztgenannte Enzymklasse bewerkstelligt die post-translationale Modifikation von Histonen. Solche Modifikationen, die Acetylierung als Beispiel, können entweder direkt oder durch die Rekrutierung anderer Effektor-Proteine zu strukturellen Veränderungen des Chromatins führen. Mit der Histon-Acetylierung eng verknüpft, ist der Prozess der Dosiskompensation in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, welcher als Modellsystem für die Erforschung der Chromatinregulation dient. Der involvierte Multiproteinkomplex beinhaltet ein Enzym, MOF (males absent on the first), mit H4K16-spezifischer Histonacetyltransferase-Aktivität. Andere Proteine, die schon länger als MOF-assoziierte Proteine bekannt sind, umfassen die MSL (male specific lethal) Proteine. Die jüngste biochemische Aufreinigung MOF-enthaltender Komplexe, brachte zusätzlich zu den MSL Proteinen, eine Reihe an neuartigen, mit MOF interagierenden Drosophila- und Säuger-Proteinen zum Vorschein (Mendjan et al., 2006). In meiner Doktorarbeit war ich daher daran interessiert, ob diese neuartigen Proteine, die wir NSL (non-specific lethal) Proteine nannten, in einem Komplex (ähnlich der MSL-Proteine) vorliegen und was deren Funktion ist. Interessanterweise fanden wir, dass eines der NSL-Proteine, NSL1, eine MSL-1-ähnliche Domänenarchitektur aufweist. Ein Großteil dieser Doktorarbeit befasst sich daher mit der detaillierten Analyse des NSL1-Proteins. Unter Verwendung von Koimmunopräzipitations- und in vitro Interaktions-Experimenten, konnte ich zeigen, dass NSL1 eine direkte Interaktion mit MOF eingeht. Durch die Strategie einer Affinitätsreinigung des NSL1-Proteins konnte ich in meiner Doktorarbeit zeigen, dass NSL1 mit anderen NSL-Proteinen in einem Komplex interagiert, der verschieden vom MSL-Komplex ist. Ich konnte weiterhin durch Immunfluoreszenzmikroskopie demonstrieren, dass zwei Komponenten dieses Komplexes, NSL1 und MCRS2, an Hunderten von Stellen auf allen polytänen Chromosomen kolokalisierten, was nahelegte, dass diese Proteine sehr wahrscheinlich nicht nur biochemisch interagieren sondern auch in vivo zusammenarbeiten. Dieser Teil meiner Arbeit hat dadurch neue Einblicke in die Existenz des NSL-Komplexes in Drosophila gewährt und konnte zeigen, dass MOF mit zwei unterschiedlichen Sätzen an Proteinen, den MSL- und den NSL-Proteinen, assoziiert vorliegt. Im zweiten Teil meiner Doktorarbeit analysierte ich die Gesamtbeteiligung der MSL- und NSL-Komplexe an der Modulation der Histonacetylierung. Dies wurde durch eine quantitative massenspektrometrische Analyse von endogenen Histonen aus Drosophila Zelllinien, die mittels RNA-Interferenz von MOF, MSL-1 oder NSL1 depletiert wurden, erreicht. Diese Arbeit offenbarte, dass MOF an der Mehrheit der H4K16 –Acetylierung in Drosophila Zelllinien beteiligt ist und dass MSL-1 eine wichtige Rolle bei der Regulierung der MOF-Aktivität in vivo übernimmt. Überraschenderweise konnten wir keine wesentlichen Veränderungen des Histon-Acetylierungsniveaus nach NSL1 Depletion in vivo feststellen. Interessanterweise zeigten NSL1-depletierte Zellen Defekte in der Zellproliferation und –segregation. Die Funktion von NSL1 in vivo bleibt schwer zu fassen. Zukünftige Arbeiten werden daher notwendig sein, um das Wirkprinzip dieser neuen Drosophila Proteine zu erklären. Der Grundstein dafür wurde gelegt.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Sattler, Prof. Dr. Michael
Date of thesis defense: 22. November 2007
Date Deposited: 17. Dec 2007 15:38
Date: 2007
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Chromatin, Genregulation, Histon-Acetyltransferase, Drosophila, Dosiskompensation
Uncontrolled Keywords: Males absent on the first , non-specific lethal 1Males absent on the first , non-specific lethal 1, dosage compensation, gene regulation
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