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Post-translational regulation and evolution of plant gamma-glutamate cysteine ligase

Gromes, Roland

German Title: Posttransaltionale Regulation und Evolution pflanzlicher gamma-Glutamat-Cystein-Ligase

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Abstract

Glutamate cysteine ligase (GCL) is catalyzing the rate-limiting step in glutathione (GSH) synthesis. A complex regulation of this enzyme is required to integrate various signals as GSH is fulfilling a plethora of functions in housekeeping metabolism, stress defence, and in the regulation of development. In this thesis the post-translational redox regulation of plant GCL and closely related proteobacterial enzymes was studied. The crystal structure of Brassica juncea GCL (BjGCL) revealed the presence of two intramolecular disulfide bridges. Biochemical analyses of the wild-type enzyme and of mutants lacking cysteines required for the formation of either disulfide bridge showed that both bridges are involved in the in vitro redox regulation of BjGCL. One disulfide bridge (CC1) is apparently controlling access to the active site and knock-out results in a slower overall catalysis rate without changes in Km-values. The second disulfide bridge (CC2) controls the formation of a GCL homo-dimer and reduction of this disulfide bridge leads to monomerization and almost complete deactivation of the enzyme. Sequence analysis showed that only CC2 is conserved in all higher plants while the occurrence of CC1 is restricted to the Rosids clade. Characterization of the redox regulation of GCL from the (non-Rosid) Nicotiana tabacum confirmed the presence of only the dimerization-dependent mechanism of redox regulation. Furthermore, it could be shown that feedback-inhibition of plant GCL by GSH is mechanistically independent from redox regulation. A model is presented on how these different mechanisms interact to control GSH synthesis in vivo. Comparative sequence analysis of plant GCL and with related enzymes from proteobacteria revealed that the amino acid residues forming the dimer interface in BjGCL are conserved in higher plants only, while the catalytic residues are highly conserved among all sequences. The characterization of recombinantly produced GCL from Agrobacterium tumefaciens and Xanthomonas campestris confirmed that these enzymes show kinetics and susceptibility to inhibitors similar to the plant enzyme but completely lack redox regulation and are active as monomers. In a second project, the influence of soluble thiols on the GSH metabolism of different types of cultured plant cells was studied, revealing a specific induction of GCL expression by cysteine. This observation may hint at a role of GSH synthesis in the control of the cellular concentrations of this amino acid, preventing an accumulation which might lead to oxidative stress.

Translation of abstract (German)

Glutamat-Cystein-Ligase (GCL) katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Synthese von Glutathion (GSH). Eine komplexe Regulation dieses Enzyms, die eine Fülle verschiedener Signale integriert, ist notwendig, da GSH mannigfaltige Funktionen im Haushalts- und Stressstoffwechsel sowie in der Regulation von Entwicklungsprozessen erfüllt. In dieser Arbeit wurde die post-translationale Redox-Regulation pflanzlicher GCL und verwandter proteobakterieller Enzyme untersucht. Zwei intramolekulare Disulfidbrücken konnten in der GCL von Brassica juncea (BjGCL) in der Kristallstruktur identifiziert werden. Eine Beteiligung beider Disulfidbrücken an der in vitro Redox-Regulation konnte durch biochemische Analysen am Wildtyp-Enzym und Mutation der Cysteine nachgewiesen werden. Der Knockout einer der Disulfid-Brücken (CC1) führte zu einer Verringerung der Katalysegeschwindigkeit, möglicherweise durch eine Veränderung der Zugänglichkeit des aktiven Zentrums, ohne dabei die Km-Werte des Enzyms zu beeinflussen. Die andere Disulfidbrücke (CC2) kontrolliert die Bildung eines GCL Homodimers und das Aufbrechen führt zu einer Monomerisiersung und zu fast vollständiger Inaktivierung des Enzyms. Sequenzanalysen zeigten, dass nur CC2 in allen höheren Pflanzen konserviert ist, während das Vorkommen von CC1 sich auf die Rosiden beschränkt. Die Charakterisierung der GCL aus (der nicht-Roside) Nicotiana tabacum bestätigte das alleinige Vorhandensein des dimerisierungsabhängigen Mechanismus der Redox-Regulation. Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass die Inhibition pflanzlicher GCL durch GSH mechanistisch unabhängig von der Redox-Regulation ist. Das mögliche Zusammenwirken der verschiedenen Regulationsmechanismen zur Kontrolle der GSH-Synthese in vivo wird in einem Modell dargestellt. Vergleichende Sequenzanalyse zeigte eine Konservierung der Aminosäurereste, die bei BjGCL die Dimerisierung ermöglichen, nur in höheren Pflanzen, während die katalytischen Reste in allen Sequenzen hoch konserviert sind. Die Charakterisierung der GCL aus Agrobacterium tumefaciens und Xanthomonas campestris bestätigte, dass diese eine ähnliche Kinetik und Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren zeigen, wie die pflanzlichen Enzyme, aber keinerlei Redox-Regulation aufweisen und als Monomere aktiv sind. In einem weiteren Projekt wurde der Einfluss löslicher Thiole auf den GSH-Stoffwechsel verschiedener kultivierter Pflanzenzellen untersucht und eine spezifische Induktion der GCL-Expression durch Cystein nachgewiesen. Dies weist auf eine Rolle der GSH-Synthese bei der Kontrolle der zellulären Konzentration dieser Aminosäure hin, deren Akkumulationen zu oxidativem Stress führen könnte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rausch, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 18 December 2007
Date Deposited: 08 Jan 2008 11:53
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 580 Botanical sciences
Controlled Keywords: Glutamat-Cystein-Ligase, Indischer Senf, Tabak, Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas campestris, Evolution, Enzymatische Regulation, Glutathi
Uncontrolled Keywords: RedoxregulationRedox regulation
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