English Title: Equine sarcoids - Modelsystem for the immune therapy of papillomavirus-associated disease : First steps towards the establishment of a Granzyme B ELISPOT detection assay for the detection of cytotoxic T-cells in equids

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Abstract

Infektionen mit bestimmten Papillomviren sind mit der Entstehung von Tumoren assoziiert. So sind z.B. das Zervixkarzinom (zweithäufigste Tumorart bei Frauen weltweit), sowie equine Sarkoide (häufigster Hauttumor bei Pferden) kausal mit high risk HPV-, respektive BPV 1 und BPV 2 Infektionen verbunden. Zur Prävention des Zervixkarzinoms liegt ein Fokus der HPV-Forschung auf der Entwicklung prophylaktischer Vakzinierungsansätze. Kürzlich wurden die ersten HPV Impfstoffe kommerzialisiert. Diese basieren auf Virus ähnlichen Partikeln, welche in immunisierten Patienten Virus neutralisierende Antikörper induzieren. Hierdurch können Primärinfektionen verhindert werden und es wird erwartet, dass hierdurch, auf lange Sicht betrachtet, die Zahl der Zervixkarzinomfälle reduziert wird. Aufgrund der langen Latenzzeit zwischen Primärinfektion und Auftreten des Tumors besteht zudem ein Bedarf an Therapiemöglichkeiten für bereits infizierte oder erkrankte Patientinnen. Im Falle equiner Sarkoide steht z.Zt. ebenfalls noch keine geeignete Therapie zur Verfügung. Ein vielversprechender Therapieansatz zu Behandlung PV-assoziierter Tumoren ist die Vakzinierung mit chimären Virus-ähnlichen (CVLP) Partikeln mit dem Ziel der Induktion spezifischer, gegen Tumorantigene gerichteter zytotoxischer T Zellen (CTL). Als geeignete Tumorantigene gelten in diesem Zusammenhang die viralen Onkoproteine E5, E6 und E7. Um therapeutische Vakzinierungsansätze zu testen, ist die Messung der Vakzin-induzierten CTL notwendig. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, ein geeignetes Nachweisverfahren zur Detektion zytotoxischer T-Zellen in Equiden bereit zu stellen. Hierzu sollte ein ELISPOT-Verfahren zum Nachweis der Granzym B (GrzmB)-Sekretion aktivierter CD8+ CTL in Pferden etabliert werden. Zu diesem Zweck wurde die equine GrzmB-cDNA-Sequenz isoliert und charakterisiert. Durch phylogenetische Analysen konnte die Verwandtschaft zu Mitgliedern der Granzym B-Familie gezeigt werden. Das Genprodukt wurde auf GrzmB spezifische Aktivität hin analysiert und monoklonale Antikörper gegen das Protein generiert. Die Antikörper konnten in immunologischen Verfahren wie Western blot, Immunfluoreszenz und ELISA zur eqGrzmB-Detektion eingesetzt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Antikörper transient in 293TT- und ED-Zellen exprimiertes eqGrzmB im ELISPOT-Verfahren detektieren können. Somit wurden erste Schritte zur Etablierung eines eqGrzmB-ELISPOT Verfahrens zum Nachweis Vakzin-induzierter CTL-Reaktionen getätigt. Zusätzlich wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit für eine Immunisierungsstudie an Sarkoid tragenden Eseln (Kooperationsprojekt mit Prof. S. Campo / Universität Glasgow), das zur Immunisierung der Tiere benötige Antigen (BPV 1 L1/E7 cVLP) zur Verfügung gestellt. Zudem wurden Serumproben immunisierter Tiere auf die Anwesenheit spezifischer BPV 1 L1, sowie BPV 1 E7 Antikörper untersucht.

Translation of abstract (English)

Papillomavirus infections can lead to the onset of certain types of cancer. For instance equine sarcoids, the most frequent type of skin tumor in horses, are causally linked to infections with BPV 1 or 2. Likewise, infections with high risk HPV are linked to the development of cervical cancer, the second most frequent type of cancer in women worldwide. One focus of HPV research is the development of prophylactic vaccines to inhibit HPV-infection in women. Recently, the first two prophylactic HPV vaccines have been commercialized. They are based on so-called virus-like particles, which are able to induce virus neutralizing antibodies in immunized patients. These antibodies can inhibit primary infection and it is expected that in the long term this may reduce the number of cervical cancer cases. Due to the long latency between primary infection and onset of the tumor there is a need for therapeutic treatment of infected patients and women suffering from cervical cancer. In the case of equine sarcoids there is currently no adequate therapy available. One promising therapeutic approach to treat PV-associated tumors is the vaccination with chimeric virus like particles (CVLP) that are able to induce tumorantigen-specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL). In this context the viral oncoproteins E5, E6 and E7 are considered as suitable tumor antigens. To assess the success of therapeutic vaccination it is mandatory to measure the vaccine-induced CTL responses in vitro. The main objectice of the thesis was to provide a screening method for the detection of cytotoxic T-lymphocytes in equids. For this, an ELISPOT for the detection of Granzyme B (GrzmB)-release of activated horse CTL should be established. For this purpose the equine GrzmB cDNA was isolated and characterized. By the use of phylogenetic analysis tools the close relationship of the isolated cDNA-sequence to members of the GrzmB-Family could be confirmed. The gene product was analyzed for GrzmB-specific activity and monoclonal antibodies against the protein were generated. The antibodies were successfully used in immunological assays such as Western blot, immunofluorescence and ELISA. Furthermore, it was shown that the antibodies can be used in ELISPOT assay to detect eqGrzmB if transiently expressed by two cell lines (293TT and ED). By this, first steps towards the establishment of an eqGrzmB-ELISPOT for the detection of vaccine-induced CTL reactions in horses were taken. In addition, the group of Prof. S. Campo (University of Glasgow) performed a vaccination trial on sarcoid-bearing donkeys. Within this project the antigen (BPV1 L1/E7 CVLP) for immunization was produced and provided. Additionally, serum samples of vaccinated animals were analyzed for the presence of BPV1 L1- and E7-specific antibodies.