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Active zone proteins Bassoon and Piccolo at the calyx of Held : age - dependent localization and targeted in vivo perturbation

Dondzillo, Anna

German Title: Die altersabhängige Lokalisation von Bassoon und Piccolo in der aktiven Zone der Heldschen Calyx und ihre gezielte Pertubation in vivo

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Abstract

Neurons communicate with each other via synaptic transmission. Chemical synapses transfer information through the release of neurotransmitter. In contrast to the very detailed knowledge of the functional capabilities of synapses and the fact that most presynaptic proteins have been identified, the molecular mechanisms underlying neurotransmitter release remain poorly understood. The active zone (AZ), the site of Ca2+-dependent neurotransmitter release in nerve terminals, is a morphological specialization of the presynaptic plasma membrane with a set of proteins necessary for the organization of exo- and endocytotic molecular machineries. Bassoon and Piccolo are structurally related, large multidomain proteins specifically and exclusively located in AZs of the mammalian nervous system, they are thought to organize AZs through their multidomain capability of interaction with many other proteins. Specific deletion of Bassoon in mice resulted in a significantly lower number of active synapses in hippocampal autaptic cultures. Bassoon deletion did not result in compensatory changes of AZ proteins but Piccolo, which was increased 1.4 times. Hence, the presence of Piccolo may prevent a loss of function in Bassoon knockout mice. To assess the role of Bassoon and Piccolo in neurotransmitter release, we examined their localization in the calyx of Held giant presynaptic terminal and attempted a simultaneous knockdown of both proteins using RNA interference. First, we examined the three-dimensional (3D) localization of Bassoon and Piccolo in the rat calyx of Held between postnatal days (P) 9 and 24, a period characterized by pronounced structural and functional changes. To unequivocally assign immunohistochemical (IHC) signals to the calyx, we expressed membrane-anchored GFP (mGFP) or synaptophysin-GFP in the calyx using targeted stereotaxic delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors. We then examined the distribution of Bassoon and Piccolo using IHC in slices containing calyces with labeled plasma membrane or synaptic vesicles (SV) using confocal microscopy and 3D reconstructions. We found that both Bassoon and Piccolo were arranged in clusters resembling the size of AZs. These clusters were located in the presynaptic membrane facing the principal cell, close to and partially overlapping with SV clusters. Simultaneous application of both antibodies revealed a ~90% overlap, indicating that both proteins co-localize. We found about 200-400 clusters in both P9 and P24 calyces. The number and distribution of clusters did not differ, suggesting that these parameters do not contribute to postnatal functional maturation. Furthermore, we observed IHC-signals in the spaces between finger-like protrusions of the calyx, consistent with intermingled non-calyceal inputs located on the principal cell. As these signals mimic a calyx-like distribution, particularly in 2D images, pre-labeled calyces are essential for IHC studies of protein distribution in the calyx of Held. To understand the function of Bassoon and Piccolo in AZ organization and their contribution to neurotransmitter release, we attempted to down-regulate each of these proteins in vivo in the calyx of Held using RNA interference. Small hairpin RNAs (shRNA) directed against Bassoon and Piccolo were expressed through AAV vectors. Viral particles were stereotaxically delivered to the ventral cochlear nucleus, where the somata of neurons giving rise to calyx terminals are located. Using 3D fluorescence immunohistochemistry, we could demonstrate a down-regulation of Piccolo at its most relevant site - the nerve terminal. With this approach we were able to show a decreased amount of Piccolo in the calyces treated with shRNA as compared to control calyces. Preliminary results suggest a knockdown of Bassoon using the same approach. However, low titers of the virus preparations did not yield numbers of perturbed calyces sufficient for functional analyses in brain slices. This also precluded knocking down Bassoon and Piccolo simultaneously. Attempts of improving viral titers remained unsuccessful, posing a potential general limitation to AAV-mediated applications of shRNAs for targeted in vivo RNA interference.

Translation of abstract (German)

Nervenzellen kommunizieren untereinander über Synapsen, wobei chemische Synapsen die Information durch die Ausschüttung von Neurotransmittern übertragen. Während die funktionellen Aspekte der Präsynapse gut untersucht und die meisten der ihrer Proteine identifiziert sind, bleiben die exakten molekularen Mechanismen die zur Ausschüttung der Neurotransmitter führen unklar. Die aktive Zone (AZ), der Ort in den Nervenendigungen, an dem die Ca2+-abhängige Neurotransmitterausschüttung stattfindet, ist ein spezieller Abschnitt der präsynaptischen Plasmamembran, der sich morphologisch von Rest der Zelle unterscheidet, und in dem Proteine der Exo- und Endocytosemaschinerie vorliegen. Bassoon und Piccolo sind strukturell verwandte, große Multidomänenproteine die spezifisch und exklusiv in den AZs des Nervensystems von Säugern vorliegen. Es wird vermutet, dass Bassoon und Piccolo die Grundstruktur der AZ bilden, wobei ihr Multidomänenaufbau die Wechselwirkung mit diversen anderen Proteinen der AZ erlaubt. Die spezifische Ausschaltung von Bassoon in Mäusen führte zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl von Synapsen in autaptischen Kulturen des Hippocampus. Außer einer 1,4fachen Hochregulierung von Piccolo wurden jedoch keine durch die Ausschaltung von Bassoon verursachten kompensatorischen Veränderungen in den Mengen anderer AZ-Proteinen beobachtet. Die Anwesenheit von Piccolo könnte also einen Verlust der Funktion in Bassoon-knock-out-Mäusen verhindern. Zur genaueren Bestimmung der Rolle von Basson und Piccolo untersuchten wir ihre Lokalisation in der Heldschen Calyx, einer Riesennervenendigung, und versuchten beide Proteine mittels RNA interference auszuschalten. Zunächst untersuchten wir die dreidimensionale (3D) Lokalisation von Bassoon und Piccolo in der Heldschen Calyx der Ratte zwischen dem neunten und vierundzwanzigsten Tag nach der Geburt, einer Phase in der bedeutende strukturelle und funktionelle Veränderungen der Synapse stattfinden. Um immunhistochemische Signale zweifelsfrei der Calyx zuordnen zu können, wurden membrangebundenes GFP (mGFP) oder Synaptophysin-GFP gezielt in der Calyx exprimiert. Dabei wurden stereotaktische Injektionen von adeno-assoziierten Viren (AAV) als Vektoren für die GFP-Konstrukte benutzt. Danach bestimmten wir die Verteilung von IHC-Signalen gegen Basson und Piccolo in Hirnschnitten markierter Calyces (Plasmamembran oder synaptische Vesikel (SV)). Dazu wurden konfokale Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionen verwendet. Hierbei stellten wir fest, dass sowohl Bassoon als auch Piccolo in Clustern, die der Größe der AZ entsprachen, organisiert waren. Diese Cluster befanden sich in der Plasmamembran der Calyx, die der Prinzipalzelle zugewandt war, wobei in der Nähe und teilweise mit dem IHC-Signal von Bassoon und Piccolo überlappend, SV-Cluster detektiert wurden. Die gleichzeitige Applikation von Antikörpern gegen beide Proteine führte dazu, dass eine ca. 90%ige Überlappung der IHC-Signale erhalten wurde, was darauf hindeutet, dass die beiden Proteine kolokalisiert vorlagen. Es wurden sowohl in P9 als auch in P24 Ratten 200-400 Bassoon- bzw. Piccolo-Cluster pro Calyx detektiert. Weder die Anzahl noch die Verteilung der Cluster unterschieden sich in den beiden Altersgruppen, was zu der Annahme führt, dass diese beiden Parameter keine Rolle bei der funktionellen Reifung des Calyx spielen. Außerdem fanden wir IHC-Signale zwischen den fingerähnlichen Fortsätzen des Calyx, welche zu anderen Synapsen der Prinzipalzelle als der Calyx gehören. Da diese Signale aber besonders in 2D-Bildern eine Calyx-ähnliche Verteilung besitzen, ist eine vorher markierte Calyx, beispielsweise mit mGFP, essentiell um IHC-Studien in der Heldschen Calyx durchführen zu können. Um die Funktion von Bassoon und Piccolo bei der Organisation der AZ und ihren Beitrag zur Neurotransmitterfreisetzung besser zu verstehen, versuchten wir jedes der Proteine mittels RNA interference in vivo herunter zu regulieren. Small hairpin RNAs (shRNAs), gegen Bassoon oder Piccolo gerichtet, wurden mittels AAV-Vektoren exprimiert. Dazu wurden Viruspartikel stereotaktisch in den ventralen cochlearen Nukleus, der die Somata der Neuronen welche die Heldsche Calyx bilden enthält, injiziert. Mit Hilfe von 3D Fluoreszenzimmunhistochemie konnten wir eine Herunterregulierung von Piccolo in shRNA exprimierenden Calyces detektieren. Ähnliche, vorläufige Ergebnisse wurden mit dieser Methode bei entsprechenden Versuchen zur Herunterregulierung von Bassoon erhalten. Die niedrigen Titer der Viruspräparationen führten allerdings nicht zu einer für die funktionelle Analyse ausreichenden Anzahl von Calyces die shRNA exprimierten. Das gleiche Problem trat auch bei dem Versuch auf Bassoon und Piccolo gleichzeitig herunterzuregulieren. Eine Erhöhung der Virustiter war nicht möglich, so dass hier eventuell eine generelle Grenze der Anwendbarkeit von AAV-vermittelter shRNA-Expression zur gezielten RNA interference in vivo erreicht wurde.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Kuner, Prof. Dr Thomas
Date of thesis defense: 20 December 2007
Date Deposited: 04 Feb 2008 14:06
Date: 2007
Faculties / Institutes: Service facilities > Max-Planck-Institute allgemein > MPI for Medical Research
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Synapse
Uncontrolled Keywords: Heldschen Calyx , Active Zonegiant synapse , viral mediated gene expression , Bassoon , Piccolo
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