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Target Recognition by Natural Killer Cells : Identification and Characterization of Inhibiting and Activating Factors

Hoffmann, Sabrina

German Title: Zielzell-Erkennung durch Natürliche Killerzellen : Identifikation und Charakterisierung von inhibierenden und aktivierenden Faktoren

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Abstract

Natural killer (NK) cells are able to attack and destroy tumorous or virally infected cells without prior sensitization. The processes that regulate their activation and function are still incompletely understood. NK cells do not exress a single clonal receptor like T-cells but many different activating and inhibitory receptors. Most of the inhibitory receptors bind to MHC I or related molecules. Some activating receptors recognize ligands induced upon cell stress or transformation. One group of inhibitory receptors on NK cells is constituted by the NKG2 family. Some of these receptors form antithetic pairs. That means, they recognize the same ligands but signal in a contrary fashion. One of the most important NKG2 receptors is NKG2D. For this receptor an antithetic counterpart has not been described yet. One part of this thesis included the identification of a possible inhibitory counterpart for NKG2D. Data base searches retrieved the cDNA for CLEC12B. Characterization of the receptor lead to the result that it did not bind the known NKG2D ligands and was not expressed on NK cells. Nevertheless, it is able to confer inhibitory signaling via the recruitment of the tyrosine-phosphatases SHP-1 and SHP-2. Expression of the inhibitory receptor CLEC12B was detected on monocyte-derived macrophages. Another important group of activating receptors is constituted by the natural cytotoxicity receptors (NCR). They have been implied in antiviral defense and in the recognition of malignant cells. Although the ligand remains unknown it is still possible to detect it by applying functional assays and staining methods using soluble fusion proteins. The role of the NCR ligands has up to now not been examined in human cytomegalovirus (HCMV) infection. Fusion protein staining and functional data presented in this thesis suggest that the NCR ligands are downregulated from the cell surface. This might constitute a new immune evasion mechanism of HCMV. It was discovered that this process is mediated by a viral gene product that is expressed de novo upon infection during the immediate early or early phase of infection. The creation of viral deletion mutants helped to exclude non-essential regions of the HCMV genome. Immunofluorescence staining with fusion proteins showed that the ligand is held back in intracellular compartments. For further research the elucidation of the NCR ligands is vitally important. Heparan sulfate structures have been postulated to function as ligands but these results are debated. In this thesis, it was established that heparan sulfate is not the functional ligand for NKp30. The putative ligand was found to involve a proteinacious component that is not GPI-anchored. It was tried to identify the NKp30 ligand with the help of a genomic siRNA library. Cells expressing the NKp30 ligand were transduced with the library and selected for cells with an NKp30 negative phenotype. The siRNAs were rescued from the cell population, amplified and analyzed via an affimetrix genechip. The results show the enrichment of some interesting transmembrane or secreted proteins as possible candidates that might function as ligand for NKp30.

Translation of abstract (German)

Natürliche Killer (NK) Zellen sind in der Lage transformierte oder mit Viren infizierte Zellen ohne vorherige Sensibilisierung zu erkennen und zu lysieren. Um diese Aufgabe erfüllen zu können, verfügen NK-Zellen über verschiedene Rezeptoren mit aktivierender oder inhibierender Funktion. Die meisten inhibitorischen Rezeptoren binden an MHC I Moleküle. Einige der aktivierenden Rezeptoren erkennen Liganden, die nach Zellstress oder Transformation exprimiert werden. Eine wichtige Gruppe der NK-Zell Rezeptoren ist die NKG2-Familie. Manche dieser Rezeptoren bilden antithetische Paare, die dieselben Liganden erkennen, aber gegensätzliche Signale auslösen. Einer der wichtigsten aktivierenden Rezeptoren dieser Gruppe ist NKG2D, für den bisher noch kein inhibitorischer Gegenpart bekannt ist. Ein Teil dieser Arbeit zielte darauf ab, einen potentiellen inhibitorischen Gegenpart für den NKG2D-Rezeptor zu identifizieren. Eine Datenbanksuche identifizierte die cDNA von CLEC12B als möglichen Kandidaten. Die Charakterisierung dieses Rezeptors zeigte, daß er trotz Homologie zu NKG2D keinerlei Affinität für die bekannten NKG2D Liganden besitzt und nicht in NK-Zellen exprimiert wird. Allerdings ist er in der Lage inhibitorische Signale durch die Rekrutierung der Tyrosin-Phosphatasen SHP-1 und SHP-2 auszulösen. Die Expression von CLEC12B konnte schließlich auf aus Monozyten generierten Makrophagen festgestellt werden. Eine weitere Gruppe ist die Familie der Natural Cytotoxicity Receptors (NCR) mit den Rezeptoren NKp30, NKp44 und NKp46. Obwohl ihre Liganden bisher noch unbekannt sind, ist es möglich sie mit der Hilfe funktioneller Experimente und löslicher Fusionsproteine zu detektieren. Über die Rolle des NKp30 Liganden während einer Infektion mit humanem Cytomegalievirus (HCMV) ist bisher nichts bekannt. Über Färbungen mit Fusionsproteinen und funktionelle Experimente konnte gezeigt werden, daß im Zuge einer HCMV Infektion die Expression des NKp30 Liganden unterdrückt wird. Dieser Prozess wird durch ein virales Genprodukt ausgelöst, das de novo während der frühen Infektionsphase exprimiert wird. Über die Generierung von Deletionsmutanten konnten große Bereiche des HCMV Genoms mit nicht-essentiellen Genen ausgeschlossen werden. Immunfluoreszenz-Färbungen mit Fusionsproteinen zeigten, dass die Liganden von NKp30 in intrazellulären Kompartimenten zurückgehalten werden. Für weitere Forschung ist die Identifikation der NCR Liganden unumgänglich. Es wurde ein siRNA screen etabliert, um den NKp30 Liganden zu identifizieren. Zellen, die den NKp30 Liganden exprimieren, wurden mit einer siRNA Bibliothek transduziert und auf einen NKp30 negativen Phänotyp selektioniert. Die siRNAs wurden aus der entstandenen Zell-Population isoliert, amplifiziert und über einen affimetrix gene chip analysiert. Als Resultat ergaben sich siRNAs, die gegen einige interessante Transmembranproteine gerichtet sind. Diese möglichen Kandidaten stellen die Basis für weitere Untersuchungen dar.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Prof Günter J.
Date of thesis defense: 11. February 2008
Date Deposited: 04. Mar 2008 09:54
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Immunsystem, Natürliche Killerzelle, Aktivierung
Uncontrolled Keywords: NKp30NKp30
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