English Title: Hsp-antigen fusion proteins as murine tumor vaccines

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Abstract

Hitze-Schock-Proteine (HSP) sind bekannt dafür, die Kreuzpräsentation von Antigenen in dendritischen Zellen (DC) zu induzieren sowie DC zu aktivieren (Adjuvans-Effekt). Diese Eigenschaften machen HSP-Antigen-Komplexe zu geeigneten Kandidaten, um antigenspezifische CD8+ T-Zellen-Antworten gegen Tumor-assozierte-Antigene zu initiieren. Es gibt ca. 15-20 verschiedene HSP, aber bis jetzt ist wenig über ihre relativen immunologischen Eigenschaften (Aktivierung des Immunsystems und Kreuzpräsentation) bekannt. In dieser Arbeit wurden verschiedene HSP der HSP70-Familie (M.tuberculosis Hsp70, murines induzierbares Hsp70, murines Hsp70L1 und murines konstitutiv exprimiertes Hsc70) verglichen, die an ein Fragment von Ovalbumin (OVA) als Modell-Tumor-Antigen fusioniert wurden. Selbst geringe Mengen (100 pmol) an in E.coli hergestellten rekombinanten Hsp70-OVA konnten effiziente Antworten von OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen in Kurzzeitimmunisierungen in vivo hervorrufen. Im direkten Vergleich der hier untersuchten vier Hsp70-Typen zeigte sich M.tuberculosis Hsp70 (mtubHsp70) als das HSP mit der stärksten Immunogenität. Die Immunisierung mit Hsp70-OVA war abhängig von DC, da nach Depletion der DC in CD11c.DTR Mäusen keine CD8+ T-Zell-Antworten mehr beobachtet werden konnten. Die Immunisierung mit mtubHsp70-OVA führte zu einer signifikanten zytotoxischen Aktivität in vivo, während die Immunisierung mit dem Fusionsprotein ohne Hsp-Anteil (rekombinantes OVA-Fragment) zu keiner Zytotoxizität führte. Um zu untersuchen, ob die starken immunostimulatorischen Fähigkeiten des HSP-Anteils (Adjuvans-Effekt) durch Endotoxin-Kontamination zustande kamen, wurden die Versuche in LPS-Rezeptor (TLR4)-defizienten Mäusen wiederholt. In diesen Mäusen konnte die Immunisierung mi mtubHsp70-OVA nur eine schwache Zytotoxizität induzieren. Nach Endotoxin-Abreicherung der Hsp70-OVA Präparate konnte keine zytotoxische Aktivität nach einmaliger Immunisierung von Wildtyp-Mäusen gemessen werden. Folglich scheint die Endotoxin-Kontamination wesentlich zu der Immunogenität der rekombinanten Hsp70-OVA-Fusionsproteine beizutragen. Mehrfache Immunisierung mit Endotoxin-freiem Hsp70-OVA führte zu einer zytotoxischen Aktivität in vivo und konnte signifikant das Wachstum eines OVA-exprimierenden B16 Melanoms verlangsamen. Auch die einmalige Immunisierung mit Endotoxin-abgereichertem Hsp70-OVA in Kombination mit geringen Mengen TLR9-Ligand CpG-Oligodesoxynukleotid 1668 führte zu ähnlichen Ergebnissen in der in vivo Zytotoxizität und in der Anti-Tumorimmunität. Allerdings konnte kein signifikanter Unterschied in der Stärke der Immunantworten zwischen Endotoxin-abgereichtem Hsp70-OVA und Endotoxin-abgereichtem rekombinantem OVA-Fragment gefunden werden. Im Gegensatz zu rekombinantem OVA-Fragment war aber kommerziell erhältliches Ovalbumin aus Hühnereiweiß ein sehr schwaches Antigen. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass die starke Aggregation der Fusionsproteine wichtig für den Erfolg der Vakzinierung ist, da Hitze-Aggregierung von kommerziell erhältlichem Ovalbumin zu gleich starken Immunantworten wie die Immunisierung mit Endotoxin-abgereichertem Hsp70-OVA und rekombinantem OVA-Fragment führte. Unter nativen Bedingungen aufgereinigtes, Endotoxin-abgereichertes Hsp70-OVA induzierte keine signifikanten zytotoxischen Immunantworten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass der bisher beobachtete Adjuvans-Effekt des Hsp70-Anteil der Fusionsproteine durch die Endotoxin-Abreicherung weitgehend verloren geht. Folglich scheinen Endotoxin-abgereicherte Hsp70-OVA-Proteine keine erhöhte Fähigkeit im Vergleich zum Antigen ohne HSP-Anteil zu besitzen, zytotoxische und teilweise tumorprotektive T-Zell-Antworten zu induzieren. Daher erscheinen Endotoxin-freie Hsp70-Antigen-Fusionsproteine ungeeignet, eine starke Anti-Tumorimmunität zu induzieren. Andererseits konnte gezeigt werden, dass die Aggregation des Antigens zu einer deutlichen Verstärkung der Immunogenität führt. Diese kann auf die verstärkte Kreuzpräsentation der aggregierten Proteine zurückgeführt werden. In Kombination mit einem starken Adjuvans (hier CpG-ODN) konnte eine signifikante Anti-Tumorimmunität induziert werden.

Translation of abstract (English)

Heat shock proteins (HSPs) are known to induce cross-presentation of antigens by dendritic cells (DC) as well as DC maturation (Adjuvant effect). These properties make HSP antigen complexes good candidates to prime CD8+ T cell responses against tumor-associated antigens. There exist about 15-20 different HSPs, but little is known about their relative capacity to cross-present antigen and to activate the immune system. In this study different HSPs of the HSP70 multigene family (M.tuberculosis Hsp70, mouse inducible Hsp70, mouse Hsp70L1, and mouse constitutive Hsc70) have been compared, which were fused to a fragment of ovalbumin (OVA) used as a model tumor antigen. As little as 100 pmol E. coli-derived recombinant Hsp70-OVA fusion protein efficiently primed OVA-specific cytotoxic T cells in short-term in vivo immunization assays. M.tuberculosis Hsp70 (mtubHsp70) was found to be the most potent activator of the four studied Hsp70 fusion proteins. The vaccination with Hsp70-OVA was dependent on DCs, as depletion of DCs in CD11c.DTR mice resulted in an abrogation of CD8+ T cell responses. The vaccination with mtubHsp70-OVA led to a significant cytotoxicity in vivo, whereas recombinant OVA without the Hsp70 part did not do so. In order to study if the adjuvant effect of the Hsp70 part is due to endotoxin contamination, these experiments were repeated in mice deficient for the LPS receptor TLR4. Only weak cytotoxic T cell responses were found after vaccination with mtubHsp70-OVA in these mice. After careful removal of endotoxins, a single administration of Hsp70-OVA failed to prime cytotoxic T cell responses in wild-type mice. This suggests that endotoxins were mainly responsible for the observed immunogenicity of the recombinant HSP-OVA fusion proteins. Multiple immunizations with endotoxin-depleted Hsp70-OVA resulted, however, in cytotoxic activity in vivo and were able to significantly delay the outgrowth of OVA-expressing B16 melanoma. When endotoxin-depleted Hsp70-OVA was used in a single immunization in combination with low amounts of the TLR9 ligand CpG oligodeoxynucleotide 1668, in vivo cytotoxicity and antitumor immunity were efficiently induced as well. However, we did not detect significant differences in the strengths of the immune responses against endotoxin-depleted recombinant OVA vs. endotoxin-depleted Hsp70-OVA fusion protein. In contrast to a recombinant OVA fragment, commercially available OVA from hen egg white was, however, a very weak antigen. Further experiments showed that protein aggregation was important for the success of the vaccination, as heat denaturation of commercially available OVA restored its priming capacity to the levels of Hsp70-OVA and recombinant OVA, respectively. Native, endotoxin-depleted Hsp70-OVA was not able to induce significant cytotoxic immune responses. Altogether, my results indicate that the adjuvant effect of the Hsp70 part of the fusion protein is mostly lost after endotoxin removal. Consequently, endotoxin-depleted Hsp70-OVA fusion proteins do not appear superior to unconjugated recombinant OVA antigen in inducing cytotoxic, partially tumor-protective T cell responses. Thus, endotoxin-depleted Hsp70-OVA fusion proteins seem inadequate for the induction of strong antitumor-immunity. On the other hand, antigen aggregation strongly enhanced immunogenicity. This can be ascribed to the improved cross-presentation of aggregated proteins. In combination with a strong adjuvant (CpG-ODN), it was possible to induce a potent antitumor immunity, using aggregated antigen.