English Title: Synthesis, modification and biological application of fluorescent xanthene dyes

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Abstract

Kurzzusammenfassung Xanthenfarbstoffe, die sich vom Rhodamin- und Fluorescein-Grundgerüst ableiten, zeichnen sich durch eine intensive Fluoreszenz aus und sind daher als molekulare Sonden für bioanalytische Anwendungen und das zelluläre Imaging von großer Relevanz. In dieser Arbeit wurden Derivate von Xanthenfarbstoffen synthetisiert, die auf biologisch wichtige Metallionen ansprechen, ungewöhnliche Akkumulation und subzelluläre Verteilungen in lebenden Zellen zeigen oder Fluoreszenzsensoren für Redoxpotentiale sind. Die wichtigsten neu entwickelten Sonden und ihre Anwendungen sind hier zusammengefasst: •Fluorogene Sonde für Cu2+-Ionen Während literaturbeschriebene Cu2+ Fluoreszenzsensoren durch Fluoreszenzlöschung auf Cu2+-Ionen ansprechen, ist das dargestellte Dipicolinoylfluorescein ein seltenes Beispiel für eine fluorogene Cu2+-Sonde. Durch Cu2+ vermittelte Esterhydrolyse wird Fluorescein gebildet. Das Detektionslimit liegt bei 100 nM Cu2+. Die literaturbekannte fluorogene Sonde Diacetylfluorescein wurde für ein Screening der Esteraseaktivität von Rinderserumalbumin eingesetzt. Durch Dotierung mit Cu2+ und anderen Metallionen konnte die sehr schwache Aktivität geringfügig gesteigert werden, jedoch nicht in einem für präparative Anwendungen ausreichenden Maß. •Metallbindende Sonde Terpyridinfunktionalisierte Rhodamine reichern sich ungewöhnlich stark in lebenden Zellen an. Dies könnte auf die intrazelluläre Assoziation der Terpyridin-Einheit mit Zn2+, das proteingebunden ist, aber noch über freie Koordinationsstellen verfügt, zurückzuführen sein. Extrazelluläres Zn2+ verhindert durch die Komplexierung die Aufnahme von terpyridin-funktionalisiertem Rhodamin in die Zelle. Die zelluläre Aufnahme kann folglich durch extrazelluläres Zn2+ gesteuert werden. •Redoxsensor Während es fluoreszierende molekulare Sonden für intrazelluläre pH-Wert Messungen bereits in zahlreichen Varianten gibt, besteht ein Bedarf an Fluoreszenzsensoren für biologische Redoxpotentiale. Ein Sensor für Redoxpotentiale wurde dargestellt, indem ein Hydrochinon an einen Rhodamin-Farbstoff gekoppelt wurde. Dem Design des Redoxsensors liegt zugrunde, dass Chinone oft gute Fluoreszenzlöscher sind, während die reduzierte Hydrochinonform die Fluoreszenz meist wenig beeinflusst. Die Fluoreszenz des Rodoxsensors wird reversibel gelöscht, wenn die Hydrochinonkomponente durch H2O2 zur Chinonform oxidiert wird. Mit Thiolen kann die Hydrochinonform und die Fluoreszenz regeneriert werden.

Translation of abstract (English)

Short summary Xanthene dyes, based on a fluorescein- and rhodamine-like backbone, are known to have a intensive fluorescence and therefore a great relevance as molecular probes for bioanalytical applications and for cellular imaging. Various xanthene dye derivatives were synthesised. Dyes reporting on biorelevant metal ions, dyes useful as a fluorescent sensor for redox potentials and dyes showing unusual accumulation and subcellular distribution in live cells are reported in this thesis. The most important newly developed probes and their applications are discussed below: •Fluorogenic probe for Cu2+ ions While most Cu2+ signalling fluorescent sensors described in literature detect copper by fluorescence quenching, synthesised dipicolinoyl fluorescein is a rare example for a fluorogenic probe. Fluorescein is formed by Cu2+ induced ester hydrolysis. Detection limit for Cu2+ is 100 nM. Literature described diacetyl fluorescein was used in a screening of bovine serum albumin esterase activity. By doping with Cu2+ and other metal ions the very weak esterase activity was increased, although not sufficient for the synthetic application of the protein. •Metal binding probe Terpyridine functionalised rhodamines accumulate strongly in live cells. This may be due to intracellular association of the terpyridine moiety to protein bound, but coordinatively unsaturated Zn2+. Extracellular zinc associates to terpyridine and prevents cellular uptake of terpyridine functionalised dye. Cellular uptake of the dye can thus be controlled by extracellular zinc2+. •Redox sensor While fluorescing molecular probes for intracellular pH measurements are available in many versions, there is a demand for fluorescent sensors to determine biological redox potentials. A sensor for redox potentials was synthesised by attaching a hydroquinone to a rhodamine dye. The concept is based on quinones often being good fluorescence quenchers, while the reduced hydroquinone forms usually have a small influence on fluorescence. The fluorescence of the redox sensor is quenched reversibly when the hydroquinone component is oxidised to the quinone form by H2O2. The hydroquinone form and therefore the fluorescence can be regenerated by thiols.