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Regulation of Telomere Length and Organisation in Human Skin Cells in vitro and in vivo

Krunic, Damir

German Title: Regulation der Telomerlänge und Organisation in Humanen Hautzellen in vitro und in vivo

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Abstract

Telomeres are specialized DNA-protein structures at the ends of the linear chromosomes that form protective caps. They are composed of multi-fold double-stranded 5’-TTAGGG-3’ repeats and a 3’ single stranded overhang that loops back and invades the duplex region. The so called T-loop structure is stabilized by a number of associated proteins that protect the DNA against degradation and hinders the cellular machinery to recognize the ends as broken DNA, thus being essential for chromosomal integrity. Investigating the three-dimensional (3D) telomere distribution we now show that telomeres of the immortal HaCaT keratinocytes are distributed in distinct non-overlapping territories within the inner third of the nuclear space in interphase cells and extend more widely during mitosis. This distinct localization is abrogated in a HaCaT variant that constitutively expresses the c-Myc onco-protein. Telomeres in HaCaT-myc cells form aggregates (TAs) that are accompanied by an overall irregular telomere distribution in interphase. Since this TA formation also leads to clustering of the respective chromosomes and TA formation is present during mitosis, TAs most likely contribute to genomic instability by forcing abnormal chromosome segregation. As a first step to approach the mechanism of TA formation we compared the difference in nuclear protein expression between HaCaT and HaCaT-myc cells by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Out of 30 differentially expressed proteins, the most promising candidate was Matrin 3, a nuclear matrix protein that, being reduced in HaCaT-myc cells, suggests for a mechanism involving incorrect adhesion to the nuclear matrix. To investigate the role of telomere loss for skin aging in situ, we developed a 3D deconvolution microscopy based Q-FISH/immunofluorescence technique on individual cells in tissue sections. When investigating skin from different-age donors, we found that similar as for dermal fibroblasts and another non-proliferative cell type in the epidermis, the melanocytes, also the epidermal keratinocytes only show a minimal age-dependent telomere decline. Thus age-dependent telomere loss appears largely neglectable. However, we found significant inter-personal differences and most strikingly, intra-personal variations in telomere lengths between similar sites of the epidermis. Moreover, in 10 of 30 samples of normal skin, preferentially from sun exposed sites of elderly donors, we identified regions within otherwise normal looking epidermis with significantly shorter telomeres. Though size and number of these micro-lesions as well as amount of telomere shortening varied, all enclosed various basal and suprabasal differentiated cells. Most importantly, they were all characterized by expression of the p53 tumour suppressor gene and 53BP1 foci co-localizing with telomeres. Since the latter are representative for DNA double strand breaks and when co-localized with telomeres represent critically short uncapped telomeres, these date demonstrate that in these micro-lesions the telomeres are dysfunctional and likely represent stages of genomic instability. Such distinct areas can only be maintained when damage has occurred in a stem cell. We, therefore, postulate that damage did not cause cell death but was repaired and lead to a decreased telomere length. This reduced telomere length was then transmitted to the daughter cells. Thus each micro-lesions most likely represents the space of one stem cell compartment. We also identified shorter telomeres in skin from heavily sun-exposed individuals and in several skin sections in sites closer to the surface (outside) as compared to more protected areas of the epidermis (deeper parts of the rete ridges, deeper parts of the hair follicles). Since we further show that in skin from 16 volunteers irradiated with UVA, UVB, or a combination of UVA and UVB, distinct telomere shortening was visible already 3 days post irradiation, UV radiation is clearly a responsible factor for accelerated telomere loss in human skin. Another factor may be forced oxidative damage because also chronic and to a lesser extend acute wounds showed distinct telomere shortening. Finally, we demonstrate for the first time a population of rare cells within the epidermis which have the “longest” telomeres and which likely represent the stem cells. These cells are distributed rather randomly throughout the basal layer. Furthermore, when cultured and replated in organotypic cultures they re-establish as stem cells in the newly developing epidermis. Thus, telomere length is a valuable marker for stem cells and it is damage rather than replication-dependent telomere shortening that leads to significant shortening and potential sites of genomic instability in human skin.

Translation of abstract (German)

Telomere sind spezialisierte DNA-Proteinstrukturen an den Enden der linearen Chromosomen, die aufgrund ihrer Länge und Struktur als schützende Endkappen die Chromosomenstabilität garantieren. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass in adherent wachsenden Zellen (Keratinotzyten und Fibroblasten der Haut) die Telomere in allen Phasen des Zellzyklus eine ganz spezifische Verteilung aufweisen. Die damit verglichenen HaCaT-myc Zellen, die aufgrund der konstitutiven Expression des c-Myc Onkogens sog. Telomer Aggregate (TAs) enthalten, zeigen dagegen eine generell veränderte Verteilung. Besonders bemerkenswert war, dass die TAs auch während der Mitose erhalten blieben und in Anaphase Zellen meist nur in einer der Tochterzellen nachweisbar waren oder dass das gesamte TA in Mikrokernen ausgeschleust wurde. Diese Befunde deuten darauf hin, dass TAs zu chromosomaler Missverteilung führen und damit ein möglicher Grund für die Entstehung numerischer Aberrationen sind. In einem ersten Schritt den Mechanismus zu ermitteln, der zur TA Bildung führt, haben wir die Kernproteine der HaCaT und HaCaT-myc Zellen mit Hilfe der zweidimensionalen Polyacrylamidgel Elektrophorese verglichen. Von 30 unterschiedlich exprimierten Proteinen war das Zellmatrixprotein Matrin 3, der aussichtsreichste Kandidat, da es in den HaCaT-myc Zellen deutlich reduziert war und dies auf eine inkorrekte Adhesion der Telomere an die nukleäre Matrix hinweist. Wie die Telomerorganisation so spielt auch die Telomerlänge für die chromosomale Stabilität eine wesentliche Rolle. Telomere werden mit jedem Replikationszyklus kürzer (Endreplikationsproblem) und deshalb geht man davon aus, dass Telomerverkürzung die Hauptursache für die Alterung von proliferativ aktiven Geweben ist. Zur Untersuchung der Rolle des Telomerverlustes bei der Alterung der Haut in situ, haben wir eine 3D Deconvolutionsmikroskopie-basierte Q-FISH/immunfluoreszenz Technik entwickelt, die es erlaubt, die verschiedenen Zellen zu identifizieren und ihre Telomere individuell zu analysieren. Mit dieser Methode können wir nun zeigen, dass in der Haut von Spendern aus verschiedenen Altersgruppen die Telomere der dermalen Fibroblasten (teilen sich nur selten) aber gleichermaßen auch die Telomere der ständig proliferierenden epidermalen Keratinozyten eine nur minimale Verminderung der Telomerlänge zeigen. Somit scheint ein Alters-abhängiger Telomerverlust als Grund für die Hautalterung weitgehend vernachlässigbar. Dagegen zeigten unsere Untersuchungen aber signifikante Unterschiede zwischen Spendern gleichen Alters und unerwarteter Weise auch innerhalb eines Spenders. Besonders auffällig waren „Mikroläsionen“, Areale mit Zellen mit extrem kurzen Telomeren umgeben von Zellen mit normaler Telomerlänge. Interessanterweise waren diese Bereiche auch durch Expression des Tumorsuppressorgens p53 und durch 53BP1 Fozi charakterisiert, die mit den Telomeren ko-lokalisierten. Letzteres ist wiederum charakteristisch für ungeschützte Telomere (repräsentieren nun Doppelstrangbrüche), und weist auf stark geschädigte Zellen hin, die höchstwahrscheinlich aufgrund kritisch kurzer Telomere genomisch instabil geworden sind und so eine mögliche erst Vorstufen von Hautkrebs darstellen. Da diese Bereiche häufig in Haut von stark Sonnen-exponierten Arealen nachweisbar waren, haben wir dann gezielt Haut nach definierter UV-Exposition untersucht: Hierbei zeigte sich, dass, wenn gleichzeitig mit UVA und UVB bestrahlt wurde, in der Tat bereits nach 3 Tagen eine deutliche Telomerverkürzung vorlag,. UVA oder UVB alleine waren dagegen deutlich weniger effektiv. D.h. UV Strahlung scheint ein wesentlicher Faktor für vorschnelle Telomerverkürzung in der Haut zu sein. Für diese Interpretation sprechen auch Befunde, dass die Telomere in Bereichen, die weiter entfernt von der Oberfläche lagen (im unteren Teil der Rete Ridges, oder im unteren Teil der Haarfollikel) und damit gegenüber Strahlung besser geschützt waren, deutlich länger waren. Ein weiterer Faktor für vorschnelle Telomerverkürzung könnte massive oxidative Schädigung sein. So fanden wir in chronischen Wunden eine massive Telomer-verkürzung, während akute Wunden eine deutlich geringere Verkürzung aufwiesen. Diese Studien zeigen nun zum ersten Mal, dass es einzelne Zellen gibt, die längere Telomere aufweisen und wahrscheinlich Stammzellen sind. Nach Kultivierung und Wiedereinsetzung in organotypische. Kulturen reetablieren sie sich als Stammzellen auch in der neu sich bildenden Epidermis. Damit ist die Telomerlänge ein neuer wertvoller Marker für die Identifizierung der Stammzellen und es ist ihre exogene Schädigung und nicht die Replikation, die zu einer signifikanten Telomerverkürzung und damit zu potentieller genomischer Instabilität in den humanen Keratinozyten führen kann.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Efferth, Thomas
Date of thesis defense: 2 April 2008
Date Deposited: 11 Apr 2008 13:32
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: telomer, haut
Uncontrolled Keywords: telomere , skin
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