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Photosensitive Moleküle zur Immobilisierung von Biomolekülen an Grenzflächen

Acunman, Hatice

English Title: Photosensitive Molecules for Immobilization of Biomolecules at Interfaces

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde ein Ansatz zur Überstrukturierung, von bereits mit Gold-Nanopartikeln dekorierten Oberflächen, entwickelt. Bei letzteren handelt es sich um Glasoberflächen, die durch die Methode der mizellaren Nanolithograpie mit Gold-Partikeln strukturiert wurden. Diese sogenannten Gold-Nanodots besitzen einen Durchmesser von etwa 5 nm und befinden sich in einem Abstand von etwa 58 nm, in einer hexagonalen Anordnung zueinander. Diese Gold-Nanostruktur wurde durch Adsorption einer photolabilen Thiolverbindung, die eigens synthetisiert wurde, auf photochemischen Wege im µm-Maßstab über¬strukturiert. Neben einer Thiol-Kopfgruppe, welche die Adsorption auf den Gold-Nanopartikel unter Ausbildung einer kovalenten Gold-Schwefel-Bindung ermöglicht, weist diese Verbindung als Kopfgruppe die photolablie MeNPOC-Schutzgruppe auf. Diese kann durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von etwa 419 nm abgespalten werden. Hierbei wird eine Aminogruppe freigesetzt, welche für weitere Kopplungsreaktionen eingesetzt werden kann. Zur photochemischen Strukturierung wurden Photomasken verwendet, die eine reguläre Lochstruktur aufweisen und nach Adsorption der Thiolverbindung auf die Oberflächen aufgelegt wurden. Die Abspaltung der Schutzgruppe findet in diesem Fall nur an den freiliegenden Stellen statt, die der Strahlung exponiert sind. Auf diese Weise ist es möglich, die Struktur der Maske in eine äquivalente aminostrukturierte Oberflächenbeschichtung umzusetzen. Zur Strukturierung wurden hierbei u.a. Lochmasken eingesetzt, die einen Lochdurchmesser von etwa 1000 µm und einen Loch-zu-Loch-Abstand von etwa 1000 µm aufweisen. Die erzeugten Amino-Funktionalitäten wurden anschließend zur Protein-Immobilisierung genutzt. Hierzu wurde zunächst unter Ausbildung einer Amidbindung Biotin gekoppelt und anschließend mit Streptavidin umgesetzt. Letzteres besitzt insgesamt 4 Rezeptorstellen, an denen der Ligand Biotin durch nicht-kovalente Bindungskräfte spezifisch mit einer sehr hohen Bindungskonstante von etwa 1015 M-1 gebunden werden kann. Zur chemischen Charakterisierung der erzeugten Monolagen kamen unterschiedliche oberflächenanalytische Methoden, wie z.B. die XPS- und IRRA-Spektroskopie zum Einsatz. Auf diese Weise war es möglich, neben der Thioladsorption sowohl die Schutzgruppenabspaltung und anschließende Protein-Immobilisierung nachzuwei¬sen. Mittels XPS konnten zudem Schichtdicken für die einzelnen Umsetzungsschritte bestimmt werden, anhand derer die einzelnen Umsetzungsschritte ebenfalls gut belegt werden konnten. Diese zeigten zudem eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden Werten, die mittels QCMD bestimmt wurden. Durch den Einsatz von fluoreszenzmarkiertem Streptavidin war es darüber hinaus möglich, die unterschiedlichen Strukturierungsstufen neben rasterelektronenmikro¬skopischen auch durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bildgebend nachzuweisen. Insgesamt stellt die vorliegende Arbeit somit einen ersten Schritt zum Studium abstandsabhängiger Wechselwirkungen in komplexeren biologischen Verbundsystemen dar.

Translation of abstract (English)

This thesis describes the development of a new method, which enables to coat gold-nanostructured surfaces in a spatial selective manner with a variety of different molecules by irradiation with light. The arrangement of gold nanoparticles in hexagonal geometries on glass slides is based on the self-assembly of diblock-copolymer micelles. The diameter of these gold nanoparticles is 5 nm and the interparticle distance is 58 nm. The described method relies on the synthesis and adsorption of a thiol compound, bearing a photo-cleavable MeNPOC protection endgroup. Whereas the thiol head-group facilitates a covalent attachment on the gold-nanostructure via the formation of a gold-sulfur bond, the MeNPOC-endgroup can be cleaved by illumination with light of a wavelength of 419 nm, whereby an amino group is exposed. These so called amino-terminated gold nanodots can consequently be applied for a following coupling of biomolecules, such as proteins. The micro-structuring of interfaces relies on the application of photomasks with a regular hole-pattern which cover the surfaces prior to illumination. In that case photo-cleavage appears only in the area where the mask does not protect the substrate from light exposure. The illuminated areas have the geometry of sperhical holes having a diameter of 1000 µm and a hole-to-hole distance of 1000 µm. Afterwards, the so generated amino-functionalities were used for protein-immobilization at interfaces. Therefore, the first step was to bind a biotin, which results in a formation of an amide. In the following step streptavidin was linked to biotin. Streptavidin presents four receptor regions, where the ligand biotin can be bound in one of these specifically with a very high binding constant of 1015 M-1. For the characterization of the chemically functionalized interfaces different surface sensitive analytical methods were applied, such as Quartz Chrystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D), X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) and Infrared Reflexion Absorption Spectroscopy (IRRAS). This enabled the detection of the thiol adsorption, the elimination of the protection group and the following protein-immobilization. XPS allowed the measurement of the layer thickness for the several reaction steps. These data were in good agreement with the QCM-D results. The application of fluorescence tagged streptavidin enabled the read out successfully structured areas. In summary, this thesis presents a first step on the way to explore the complex interaction between varieties of laterally immobilized biomolecules in model systems.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Prof. Dr. Joachim P. Spatz, Dr. rer. n PD.Reiner Dahint
Date of thesis defense: 31. March 2008
Date Deposited: 30. Apr 2008 13:39
Date: 2008
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Uncontrolled Keywords: mizellare Nanolithographie , photolabile Schutzgruppe , photochemische Strukturierung , Immobilisierung von Biomolekülen , optische Mikroskopiemizellare Nanolithography , photolabile molecule , photochemical strukturing , Immobilization of Biomolecules , optical microscopy
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