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Analysis of glucocorticoid receptor function in murine lung development using cell type-specific gene ablation

Habermehl, Daniel

German Title: Analyse der Funktion des Glucocorticoidrezeptors in der Lungenentwicklung der Maus mit Hilfe von zelltypspezifischer Geninaktivierung

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Abstract

A vast body of evidence from studies in humans as well as animals illustrates the pivotal role of glucocorticoid signalling during pre- and postnatal lung maturation. Consequently, corticosteroid treatment is the established standard regimen for pre-term infants and has served to reduce incidence and severity of the major complications, respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia. Glucocorticoid effects are mediated by the glucocorticoid receptor (GR) which acts as a ligand-dependent transcription factor and controls target gene expression by DNA-binding-dependent as well as -independent mechanisms. In line with this, disruption of glucocorticoid signalling by germline inactivation of the GR gene in the mouse leads to respiratory failure and postnatal lethality. Intriguingly, mice carrying a point mutation which selectively impairs homodimeric binding of GR to its cognate response elements survive, indicating that the essential functions of GR during murine lung development are mediated via protein-protein interactions rather than DNA-binding. To further elucidate the modes of GR action which mediate these critical effects, conditional gene inactivation was employed taking advantage of the Cre/loxP recombination system. A series of mutant mice was generated, lacking GR in the mesenchyme, endothelial cells or the lung epithelium, respectively, allowing the assessment of the relative contribution of these compartments to the phenotype of the germline mutation. The beneficial effects of corticosteroids have commonly been attributed to their ability to induce the functional maturation of lung epithelial cells including the stimulation of surfactant synthesis as well as sodium and water transport across the epithelium. However, conditional inactivation of the GR gene in all epithelial cells of the developing lung did not impair survival. Although these mutant mice displayed a delayed progression through the late phases of lung maturation, this retardation did not affect respiratory function at birth and was compensated during the first days of life or an artificially prolonged pregnancy. In contrast, mice lacking GR specifically in mesenchymal cells displayed a morphogenetic phenotype strongly reminiscent of GR knockout animals and succumbed to death immediately after birth. Comparable to the germline mutants, lungs of mutant embryos did not proceed through the canalicular and saccular phases of pulmonary development but remained in the pseudoglandular stage until birth. At E18.5, they were characterized by cuboidal epithelial cells and an expansion of the mesenchymal compartment resulting in an almost complete lack of presumptive alveolar airspace. Mutant lungs showed an increased proliferation rate and failed to induce general differentiation markers such as p21cip1. Moreover, the mutation significantly altered the composition of the extracellular matrix which is known to be critical not only as a structural support but also for mesenchymal-epithelial interactions. Finally, endothelium-specific inactivation of the GR gene neither affected postnatal survival nor morphogenetic development of the lung precluding an important function of GR in endothelial cells during the development of the pulmonary vasculature. In summary, the present study demonstrates that GR in the developing murine lung epithelium is not essential for postnatal survival. Instead, critical glucocorticoid effects are mediated by GR action in the mesenchyme which is necessary to promote complete progression through the maturational phases of murine lung development. GR acts particularly in cells of the fibroblast lineage where it controls the composition of the extracellular matrix and is indispensible for the decrease in the general proliferation rate.

Translation of abstract (German)

Eine Vielzahl von Studien sowohl an Menschen als auch an Tieren hat gezeigt, dass Glucocorticoide eine zentrale Rolle in der prä- und postnatalen Lungenreifung ausüben. Daher gehört die Behandlung mit Corticoiden zur Standardtherapie frühgeborener Kinder und hat dazu beigetragen, Vorkommen und Ausmaß der wichtigsten Komplikationen zu verringern, der respiratorischen Insuffizienz sowie der bronchopulmonalen Dysplasie. Glucocorticoideffekte werden durch den Glucocorticoidrezeptor (GR) vermittelt, der als ligandengesteuerter Transkriptionsfaktor die Expression von Zielgenen über Mechanismen kontrolliert, die DNA-bindungsabhängig aber auch DNA-bindungsunabhängig sein können. In Übereinstimmung damit führt eine Blockade des Glucocorticoid-Signalwegs durch gezielte Inaktivierung des GRs in der Maus zu Atemversagen und postnataler Lethalität. Interessanterweise überleben Mäuse mit einer Punktmutation, die selektiv die Bindung von GR als Homodimer an seine entsprechenden responsiven DNA-Elemente verhindert, was darauf hindeutet, dass die wesentlichen Funktionen des GR in der Lungenentwicklung über Protein-Protein-Wechselwirkungen ausgeübt werden. Um die Wirkungsweisen des GR, die diese essentiellen Effekte vermitteln, näher zu untersuchen, wurde das Cre/loxP Rekombinationssystem zur gewebs- und/oder zelltypspezifischen Geninaktivierung angewandt. Es wurde eine Reihe von Mausmutanten generiert, denen GR entweder im Mesenchym, endothelialen Zellen oder dem Lungenepithel fehlt. Dies ermöglicht eine Einschätzung, inwiefern diese Kompartimente für den Phänotyp der Keimbahnmutante verantwortlich sind. Die positiven Effekte der Corticosteroide wurden gemeinhin ihrer Fähigkeit zugesprochen, Aspekte der funktionellen Reifung von Lungenepithelzellen zu induzieren wie die Synthese von Surfactant und den transepithelialen Transport von Natrium und Wasser. Eine konditionale Inaktivierung des GR-Gens in epithelialen Zellen der fötalen Lunge führte jedoch zu keiner Beeinträchtigung der Überlebensrate. Obwohl diese Mausmutanten eine Verzögerung der späten Phasen der Lungenreifung aufwiesen, hatte dies keinen Einfluss auf die Atemfunktion nach der Geburt und konnte in den ersten Lebenstagen oder durch eine künstlich verlängerte Schwangerschaft ausgeglichen werden. Im Gegensatz dazu starben Mäuse mit einer mesenchymspezifischen Inaktivierung des GR-Gens sofort nach der Geburt und äußerten einen Phänotyp, der in weiten Teilen mit dem der GR Knockouttiere übereinstimmt. Die Lungen dieser Mutanten verblieben bis zur Geburt in der Pseudoglandulären Phase der Lungenentwicklung und durchliefen weder die Kanalikuläre noch die Sakkuläre Phase. Am Tag E18.5 waren sie durch kuboidale Epithelzellen sowie eine Zunahme des mesenchymalen Kompartiments charakterisiert, was ein praktisch vollständiges Fehlen von zukünftigem alveolärem Luftraum zur Folge hatte. Die Lungen der Mausmutanten wiesen eine erhöhte Proliferationsrate auf und die Induktion von allgemeinen Differenzierungsmarkern wie p21cip1 blieb aus. Darüber hinaus bewirkte die Mutation eine signifikant veränderte Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix, die zum einen als strukturelles Gerüst dient aber auch in der Lage ist, mesenchymal-epitheliale Interaktionen zu beeinflussen. Schließlich beeinträchtigte eine endothelspezifische Inaktivierung des GR-Gens weder die postnatale Überlebensrate noch die morphogenetische Entwicklung der Lunge, was eine entscheidende Rolle des GR in Endothelzellen während der Entwicklung des pulmonalen Gefäßsystems ausschließt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass der GR im Epithel der Mauslunge für das Überleben nach der Geburt nicht essentiell ist. Im Gegensatz dazu vermittelt der mesenchymale GR Glucocorticoideffekte, die unabdingbar sind, um ein vollständiges Durchlaufen der Reifungsphase der Lungenentwicklung der Maus zu ermöglichen. GR wirkt spezifisch in Fibroblasten, wo er die Zusammensetzung der Extrazellulärmatrix kontrolliert und unabkömmlich ist, um die allgemeine Proliferationsrate zu reduzieren.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Schütz, Prof. Dr. Günther
Date of thesis defense: 24. April 2008
Date Deposited: 26. May 2008 10:13
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Glucocorticosteroidrezeptor, Lunge, Organogenese
Uncontrolled Keywords: Cre/loxPglucocorticoid receptor , lung development , Cre/loxP
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