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Identification of epigenetic mechanisms involved in transcriptional activation of silent HPV-16 genomes

Csernok, Andreea Iulia

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An important initial step towards cervical cancer is the integration of HPV DNA copies into the host genome. Subsequently, the viral DNA gets targeted by methylation leading to its transcriptional silencing (Jeon et al., 1995; Yu et al., 2005). Later on, demethylation of these inserted HPV genomes correlates with further progression of cervical cancer (Badal et al., 2003). Therefore, characterisation of epigenetic mechanisms involved in oncogene re-expression is required to potentially counteract cancer development. In this study, the contribution of both epigenetic mechanisms, DNA demethylation and incorporation of histone variant H3.3 for the re-activation of the viral DNA transcription was analyzed. The cervical cancer cell line CaSki harbors approximately 600 mostly methylated HPV-16 copies and provides an excellent in vitro model to study epigenetic mechanisms in the context of HPV induced carcinogenesis. DNA demethylation was induced by treatment of these cells with 5-Desoxy-Azacytidine (DAC), which led to demethylation of approximately 50% of the silent HPV-16 copies. In addition, clones stably expressing a Myc-tagged H3.3 were generated and characterized in combination with DAC treatment. On protein level, DAC treatment of CaSki cells was accompanied by an unexpected down-regulation of the oncoprotein E7, where intracellular half life was rescued after exposure to proteosomal and calpain inhibitors. Additionally, for the first time, an interaction of E7 with, the transcription activating histone arginine methyltransferase, CARM1 was detected after E7-IP by Mass Spectrometry and Western blot. On transcriptional level, a slightly down-regulation of the E7 oncogene was detectable after DAC treatment of CaSki cells. Importantly, the same treatment induced E7 transcription in CaSki clones expressing Myc-H3.3, which was verified by both qPCR and Northern blot. In summary, this study demonstrates that DAC treatment induces down-regulation of oncoprotein E7 in CaSki cells. In addition, the data imply that DNA demethylation alone is not sufficient for re-activation of silent HPV genomes, since induction of E7 transcription strictly requires both, DNA demethylation and incorporation of the histone variant H3.3 into the URR of HPV-16.

Translation of abstract (German)

Das Cervixcarzinom ist die zweithäufigste malignombedingte Todesursache bei Frauen weltweit. Pathogenetisch kommt dabei der Integration humaner Papillomviren (HPV) in das Genom ihrer Wirtszellen eine entscheidende Rolle zu (Jeon et al., 1995; Yu et al.,2005). Anschließend erfolgt die Methylierung der meisten integrierten viralen Genome, wobei die Transkription viraler Onkogene durch einige nicht-methylierte Kopien noch gewährleistet bleibt. Im Rahmen der weiteren Krankheitsprogression werden Anteile der zunächst methylierten viralen DNA dann erneut demethyliert (Badal et al., 2001). Die genaue Entschlüsselung des Zusammenwirkens dieser epigenetischen Mechanismen, deren Interaktionen zur Reaktivierung ausgeschalteter Genome führt, ist daher zum Verständnis der Entstehung und Progression des Cervixcarzinoms von entscheidender Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird die Rolle der epigenetischen Mechanismen, DNA Methylierung und Einbau des Histon Varianten H3.3 bei der Reaktivierung von HPV-16 DNA untersucht. Dabei wurde als optimales in vitro Model die Zervixkarzinomzelllinie CaSki ausgewählt. CaSki Zellen beinhalten ca. 600 integrierte und überwiegend methylierte HPV-16 Genome (Mincheva et al, 1987). Die Demethylierung von ca 50% der viralen DNA Kopien wurde durch Behandlung mit 5-Desoxy-Azacytidin (DAC) erreicht. Zusätzlich wurden CaSki Klone hergestellt, die den Histone 3.3 Varianten stabil exprimieren. Anschließende Untersuchungen ergaben, dass auf Proteinebene die Behandlung mit DAC zur Herunterregulation des Onkoproteins E7 führt. Inkubation mit Calpain- und Proteasom-Inhibitoren führte zur Hemmung der E7 Degradation in den DAC behandelten Proben. Zusätzlich wurde die Interaktion von E7 mit der Histone-Methyltransferase CARM1 mittels Immunpräzipitation und anschließender Massenspektrometrie und Western Blot nachgewiesen. Auf transkriptioneller Ebene wurde eine leichte Herunterregulation der E7 mRNA in CaSki Zellen nach DAC Behandlung detektiert. Hingegen erfolgte bei gleicher Behandlung, in den H3.3 stabilen CaSki Klonen, der Einbau des H3.3 Varianten in der regulatorischen Region (URR) des HPV-16 und damit die Induktion der E7 mRNA Transkription. Dies konnte mittels Chromatin-Immunpräzipitation und Northern Blot detektiert werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit DAC zur Herunterregulation von E7 in CaSki Zellen führt. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass zur erneuten Induktion der E7 Transkription aus ausgeschalteten HPV Genomen, neben DNA Demethylierung der Einbau der Histon Varianten H3.3 zwingend notwendig ist.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Zawatzky, Dr. Rainer, Prof
Date of thesis defense: 7 May 2008
Date Deposited: 26 May 2008 11:47
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Epigenetik
Uncontrolled Keywords: HPV-16 , Histone , 5-Desoxy-Azacytidine (DAC)Epigenetic , Histone , 5-Desoxy-Azacytidine (DAC) , HPV-16 , cervical cancer
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