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Hitzeschockprotein-Tumorantigen-Fusionsproteine als Vakzinen gegen Brustkrebs

Kühnle, Marie-Cristine

English Title: Heat shock protein tumor antigen fusion proteins as vaccines against breast cancer

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Abstract

Den Hitzeschockproteinen werden neben ihrer zellbiologisch wichtigen Rolle als Chaperone auch bedeutende immunologische Eigenschaften zugesprochen. Es wurde berichtet, dass sie einerseits komplexierte Antigene durch Mechanismen der Kreuzpräsentation effektiv in den MHC-Klasse-I-Präsentationsweg einschleusen können (Suto und Srivastava, 1995), andererseits auch Immunantworten der angeborenen Immunität auszulösen vermögen (Zengh et al., 2001; Strbo et al., 2002). Daher dienen sie gleichermaßen als Initiator der adaptiven Immunantwort und können durch ihren adjuvanten Effekt die antigenspezifische zelluläre Immunität verstärken (Srivastava, 2002). Das Ziel dieser Arbeit war es, den postulierten adjuvanten Effekt der Hitzeschockproteine in Vakzinierungsstudien auszunutzen, die gegen das in Mammakarzinomen überexprimierte Tumorantigen HER2/neu gerichtet waren. Durch die rekombinante Fusion vier verschiedener Hitzeschockproteine (mHsp70, mHsc70, mHsp70L1 und m.tub.Hsp70) mit zwei HER2/neu-spezifischen, in Tandem klonierten CD8+ T-Zellepitopen TYLPTNASL und PYVSRLLGI (Hsp-HER2/neuTE) bzw. mit einem längeren Fragment, das ebenfalls das CD8+ T-Zellepitop TYLPTNASL enthielt (Hsp-Her2/neu26-136), konnte in BALB/c-Mäusen der adjuvante Hsp-Anteil der Fusionsproteine evaluiert werden. Zusätzlich wurden Fusionsproteine generiert, die eine Untersuchung des HLA-A2-restringierten HER2/neu-Epitops KIFGSLAFL im HLA-A2-transgenen HHD-Mausmodell ermöglichten (Hsp-HER2/neu299-579). Parallel zur Evaluierung des Adjuvanzeffektes wurde sowohl im BALB/c- als auch im HHD-Mausmodell die Kapazität der Fusionsproteine untersucht, eine gegen das körpereigene Protoonkogen HER2/neu gerichtete Selbst-Toleranz zu brechen und eine Immunantwort zu induzieren. Die in E. coli exprimierten rekombinanten Proteine konnten nach Nickel-Affinitätschromatographie mit hoher Reinheit (70-90 %) gewonnen und das kontaminierende LPS durch eine Behandlung mit dem Detergenz Triton X-114 auf einen verbleibenden Gehalt von 0.004-0.07 EU/µg reduziert werden. Der Vergleich der Hsp-Fusionsproteine hinsichtlich ihrer Fähigkeit, eine Immunantwort gegen ein Fremdantigen zu induzieren, zeigte, dass drei der vier Proteine (Hsp70-HER2/neuTE, Hsc70-HER2/neuTE und m.tub.Hsp70-HER2/neuTE) eine HER2/neu-spezifische T-Zellzytotoxizität in vivo induzierten, wenn sie in Kombination mit dem TLR-9 Liganden CpG verabreicht wurden. Ohne dieses Adjuvans jedoch konnte entgegen der Beobachtungen früherer Studien keine spezifische Immunantwort mehr detektiert werden, so dass vermutet wird, dass der immunstimulatorische Effekt der Hsp-Anteile in den Fusionsproteinen durch die sorgfältige LPS-Abreicherung verloren ging. In Kombination mit einer mittleren CpG-Dosis induzierten die Proteine Hsp70-HER2/neuTE, Hsc70-HER2/neuTE und m.tub.Hsp70-HER2/neuTE eine stärkere HER2/neu-spezifische Immunität in vivo als das synthetische Peptid. Diese drei Fusionsproteine aktivierten auch murine BMDC in vitro hinsichtlich einer erhöhten Expression der kostimulatorischen Moleküle CD40, CD80 und CD86, wobei hohe Proteinkonzentrationen nötig waren. Alle vier untersuchten Hsp-HER2/neuTE-Fusionsproteine konnten in einem prophylaktischen Ansatz ohne zusätzliches CpG das Wachstum des HER2/neu-überexprimierenden Tumors D2F2/E2 signifikant verlangsamen, während dies durch eine Peptidimmunisierung nicht erreicht wurde. Da in einem direkten Vergleich die Hsp-HER2/neu26-136-Fusionsproteine und das rekombinante Protein HER2/neu26-136 aber dieselbe Immunogenität besaßen, muss davon ausgegangen werden, dass in dem hier untersuchten System die Hitzeschockproteinanteile keinen verstärkenden Effekt auf die Immunantwort ausüben und der Vorteil der Fusionsproteine gegenüber dem Peptid eher auf der Proteinimmunisierung basierte. Die Immunogenität der Hsp-HER2/neuTE-Fusionsproteine reichte nicht aus, um einen therapeutischen Effekt auf das Tumorwachstum auszuüben. Ebensowenig gelang es, Gedächtnis-T-Zellantworten zu induzieren. Selbstreaktive Immunantworten gegen ein körpereigenes HLA-A2-restringiertes Epitop aus HER2/neu konnten durch Vakzinierungen mit modifizierten Peptiden induziert werden, während die Stimulation autoreaktiver T-Zellen durch die Fusionsproteine Hsp-HER2/neu299-579 nicht gelang. Die Daten der vorliegenden Arbeit lassen die Schlussfolgerung zu, dass Hsp-Fusionsproteine im HER2/neu-System mit der hier gewählten Immunisierungsstrategie offenbar keine effektive Immunstimulation bewirken. Vermutlich verlieren die Hsp-Anteile der rekombinanten Proteine ihren Adjuvanzeffekt durch die LPS-Abreicherung. Daher wird deutlich, dass für den Einsatz proteinbasierter Vakzinen in der Immuntherapie Hitzeschockproteine als Adjuvans nicht ausreichen. Stattdessen müssten andere Adjuvanzien wie z. B. GMCSF eingesetzt werden. Parallel könnten Epitopmodifikationen oder veränderte Vakzinierungsstrategien, wie z. B. die In vitro-Proteinbeladung von DC eine verbesserte Immunogenität erzeugen.

Translation of abstract (English)

Besides their important chaperone function, heat shock proteins (Hsp) have been claimed to possess impressive immunologic properties. Reports have shown that they are able to induce cross-presentation of associated exogenous antigens in the MHC class I presentation pathway and additionally have been suggested to induce innate immunity. Therefore Hsp are considered to be initiators of adaptive immune responses able to increase antigen specific immunity due to their adjuvant effects (Srivastava, 2002). The goal of this thesis was to exploit this Hsp-derived adjuvant effect in vaccination studies that were directed against the tumor antigen HER2/neu which is overexpressed in mammary carcinoma. Four different Hsp (mHsp70, mHsc70, mHsp70L1 and m.tub.Hsp70) were fused with either two HER2/neu-derived CD8+ T cell epitopes TYLPTNASL and PYVSRLLGI (Hsp-HER2/neuTE) or different fragments of the human HER2/neu protein (Hsp-HER2/neu26-136, Hsp-HER2/neu299-579) in order to evaluate the adjuvant Hsp part in the different recombinant fusion proteins. Additionally, their capacity to induce self reactive immune responses and to overcome tolerance against the self protein HER2/neu was analyzed in BALB/c and HHD HLA-A2 transgenic mice. After expression in E. coli, the recombinant proteins were purified by Ni-affinity chromatography achieving purities of 70 to 90 %. Treatment with Triton X-114 reduced LPS contamination to 0.004-0.07 EU/µg protein. The comparison of the four different Hsp fusion proteins in terms of their capacity to induce immunity against a foreign antigen showed that three out of four fusion proteins (Hsp70-HER2/neuTE, Hsc70-HER2/neuTE and m.tub.Hsp70-HER2/neuTE) induced HER2/neu specific cytotoxicity in vivo if they were applied together with the TLR-9 ligand CpG. Without CpG however, no specific immunity was detectable which implies that the immunostimulatory effect of the Hsp was mostly lost upon careful endotoxin removal. In combination with intermediate amounts of CpG the proteins Hsp70-HER2/neuTE, Hsc70-HER2/neuTE and m.tub.Hsp70-HER2/neuTE showed stronger HER2/neu specific immunogenicity in vivo as compared with the peptide. These three fusion proteins were also able to mature murine BMDC in terms of upregulation of the costimulatory markers CD40, CD80 and CD86, but high protein concentrations were needed. All four Hsp-HER2/neuTE fusion proteins significantly inhibited growth of the HER2/neu overexpressing tumor D2F2/E2 in a prophylactic setting without need of further adjuvant (CpG). This protective effect was not detectable after peptide immunization. Since a direct comparison of the Hsp-HER2/neu26-136 fusion proteins with the recombinant HER2/neu26-136 protein revealed no difference in antigen specific immunogenicity it is assumed that the Hsp did not possess a significant enhancing effect on the immune response in this system. Instead, it is believed that the observed immunogenic advantage of the fusion proteins over the peptide is due to protein immunization versus peptide immunization in general. The immunogenicity of the Hsp-HER2/neuTE fusion proteins was not strong enough to exert a therapeutic effect on pre-implanted tumor or to induce HER2/neu-specific memory T cell responses. The induction of immunity against a HLA-A2-restricted self epitope in HER2/neu could, however, be achieved by peptide immunization with modified peptide epitopes, but was not observed after vaccination with the Hsp-HER2/neu299-579 fusion proteins. Our results suggest that Hsp fusion proteins are in contrast to previous reports not efficient in the HER2/neu system in inducing immunity. Since the evaluated Hsp possessed only low adjuvant effect probably due to LPS removal, it becomes clear that additional adjuvants such as CpG are needed for the use of protein-based vaccines in immunotherapy. Besides the inclusion of adjuvants, epitope modifications including xenogeneic sequences or alternative vaccination strategies e. g. immunization with in vitro protein-loaded DC may be beneficial in the future.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Hämmerling, Professor Günter J.
Date of thesis defense: 5 June 2008
Date Deposited: 17 Jun 2008 11:00
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Tumorimmunologie, Tumorantigen, Impfstoff, Impfung, Rekombinantes Protein, Adjuvans
Uncontrolled Keywords: Hitzeschockprotein , Chaperon , Tumorvakzinierungtumor vaccination , tumor antigen , heat shock protein , chaperone , adjuvant
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