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Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie zur Untersuchung von Metallkomplex-Reaktionen im thermodynamischen Gleichgewicht

Kiel, Alexander

English Title: Application of Single Molecule Fluorescence Spectroscopy to study Reaktions of Metal-Complexes in thermodynamic Equilibrium

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Abstract

Die Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie wurde in den letzten Jahren erfolgreich zur Untersuchung biologischer Fragestellungen eingesetzt. Dynamische Wechselwirkungen kleiner Biomoleküle, wie z.B. DNS, RNS, Proteine oder enzymkatalytischer Reaktionen, konnten beobachtet werden. Aufbauend auf diesen Verfahren konnte in dieser Arbeit die Grundlage zur Untersuchung heterogener oder homogener katalytischer Reaktionen einfacherer organischer oder anorganischer Systeme geschaffen werden. Dazu wurde eine Fluoreszenzsonde entwickelt, deren Fluoreszenz durch Cu(II)-Ionen gelöscht wird. Die Sonde besteht aus einem DNS-Doppelstrang, welcher als starres Gerüst dient, und endständig mit einem Cu(II)-spezifischen Liganden 4,4’-Dicarboxy-2,2’-bipyridin (dcbpy) sowie einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Um einen geeigneten Fluoreszenzmarker zu finden, wurde eine Reihe Farbstoffe bezüglich ihrer Fluoreszenzlöschung durch Cu(II) charakterisiert. Als besonders geeignet wurden die Farbstoffe Tetramethylrhodamin (TMR), Atto620, MR121 und Atto635 ausgewählt und die Sonde damit markiert, eine bis zu 92-prozentige Fluoreszenzlöschung nach Bindung von Cu(II) am Liganden konnte beobachtet werden. Zur Untersuchung, ob die Ligand-Modifikation ursächlich für die verstärkte Löschung durch Cu(II) ist, wurden Kontrollmessungen mit einer Sonde ohne dcbpy-Modifikation durchgeführt. Mit Ausnahme der Atto635-markierten Sonde konnte bei allen Sonden eine verstärkte Löschung durch den dcbpy-Liganden beobachtet werden. Die beste Unterscheidbarkeit zwischen Ligand-markierter- und Kontrollsonde ergaben die Farbstoffe Atto620 und TMR. Zur quantitativen Bestimmung der Komplexgleichgewichtskonstante aus der Fluoreszenzlöschung wurde die Stern-Volmer Theorie auf die hier entwickelten Sonden angepasst, so dass eine Restfluoreszenz im gelöschten Zustand berücksichtigt werden konnte, und der experimentelle Kurvenverlauf erklärt werden konnte. Die Anpassung der Modellparameter erlaubt die Bestimmung der Gleichgewichtskonstante der Komplexbildung K, sowie der relativen Quantenausbeute des gelöschten Zustands Aus. Für die mit Atto620 markierte Sonde wurde K zu 5,9 ∙ 106 M-1 und Aus zu 35 % bestimmt, für die mit TMR markierte Sonde ergab sich K zu 8,5 ∙ 106 M-1 mit Aus = 8 %. Die Spezifität der Sonden wurde mit Löschexperimente in Gegenwart von Mn(II), Fe(II), Ni(II), und Co(II) an der TMR-markierten Sonde untersucht und mit dem modifizierten Stern-Volmer Modell ausgewertet. Mit Ausnahme von Ni(II), das eine relative Quantenausbeute im gelöschten Zustand Aus von 22 % zeigte, stören diese Ionen mit Aus von > 55 % die Messung von Cu(II) kaum. Mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie wurde die Fluoreszenzlöschung durch Komplexbildung der TMR- und der Atto620-markierten Sonde mit Cu(II) untersucht. Dazu wurde die Sonde auf einer Glasoberfläche immobilisiert und die Fluoreszenz einzelner Sonden nacheinander mit einem konfokalen Mikroskop aufgezeichnet. Dies ermöglichte erstmals die direkte Beobachtung aufeinander folgender Assoziations- und Dissoziationsereignisse. Die Ereignisse sind als Sprünge zwischen zwei Fluoreszenzintensitätsstufen erkennbar, d.h. die Sonde wechselte durch Bindung von Kupfer(II) von einem stark fluoreszierenden An-Zustand in einen schwach fluoreszierenden Aus-Zustand. Dieses Verhalten wurde sowohl bei der TMR-Sonde als auch der Atto620-Sonde beobachtet, wobei sich die Fluoreszenzrate bei der TMR-Sonde um ~90 % verringerte und bei der Atto620-Sonde um ~66 %, in sehr guter Übereinstimmung mit den Ensemble-Messungen. Zur quantitativen Bestimmung der Assoziations- bzw. Dissoziationsraten wurde die Dauer dieser einzelnen Zustände mit Hilfe der Schwellwertanalyse ermittelt und schließlich aus der Häufigkeitsverteilung die Reaktionsraten bestimmt. Zur Verbesserung der Zeitauflösung wurden weitere Analysemethoden angewendet: die Autokorrelation des Fluoreszenzsignals sowie ein computergestützter Algorithmus auf Basis eines „Hidden Markov“ Modells (HMM). Beide Methoden zeigten eine weitere schnellere Kinetik mit An- und Aus-Zeiten von wenigen Millisekunden die in unregelmäßigen Abständen auftrat. Mit der auf HMM-basierten Methode konnten unter Vorgabe eines Drei-Zustandsmodells die kinetischen Parameter der Komplexbildung sowie die der schnellen Fluktuationen bestimmt werden. Die Aufklärung der Ursache dieser schnellen Fluktuationen sind Bestandteil weiterer Experimente. In dieser Arbeit wurden zwei Hauptgebiete realisiert: die Entwicklung einer Fluoreszenzsonde zur Untersuchung einfacher chemischer Reaktionen an einzelnen Molekülen, was der Ausgangspunkt für die Untersuchung komplexerer Systeme, wie z.B. Metallkomplex-katalysierte Reaktionen, darstellt. Mit der Entwicklung und Automatisierung von Methoden zur Auswertung zeitlich fluktuierender Fluoreszenzintensitäten wurde die Grundlage zur Bestimmung von Kinetiken mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie gelegt. Dies ermöglichte die Bestimmung der Reaktionskinetik der Komplexbildung von Cu(II) mit einem Bipyridinderivat im thermodynamischen Gleichgewicht.

Translation of abstract (English)

In recent years single molecule fluorescence spectroscopy (SMFS) has been successfully applied in biology, to study dynamic interactions of small biomolecules like e.g. DNA, RNA, proteins or even enzymatic reactions. This work represents an extension of single molecule methods to study simple chemical reactions, and finally heterogeneous or homogeneous catalytic reactions used for organic or inorganic synthesis. In a first step, a fluorescent probe whose fluorescence was quenched upon binding of copper(II) to a ligand molecule, was developed. The probe consists of a double stranded DNA as a rigid scaffold and was labeled terminally with a copper(II) specific ligand, 4,4’-dicarboxy-2,2’-bipyridine (dcbpy), and a fluorescent dye. In order to find an appropriate dye, several were characterized with respect to their fluorescence quenching upon addition of copper(II). Tetramethylrhodamine (TMR), Atto620, Atto635 and MR121 were selected as their fluorescence quantum yield was decreased in the presence of copper, compared to the corresponding pure dyes. Control measurements were performed with a probe lacking the dcbpy-ligand. It turned out, that quenching was increased for all dyes next to the Cu(II)-binding dcbpy ligand, except of Atto635. The best differentiation with respect to the control measurements was found for Atto620 and TMR. To quantitatively determine the complex equilibrium constant K from fluorescence quenching data, the Stern-Volmer model was modified in order to account for the fact that the quenched state still exhibits residual fluorescence and thus a lower quantum yield. Fitting of the data using the modified Stern-Volmer model revealed the relative quantum yield of the quenched state Aus and the complex equilibrium constant K. For the probe containing Atto620, K was determined to 5,9 ∙ 106 M-1 and Aus to 35 %, and for the TMR-labeled probe, K = 8,5 ∙ 106 M-1 and Aus = 8 %. To study the specificity of the probes, quenching experiments in the presence of other divalent metal ions were performed, i.e. Mn(II), Fe(II), Ni(II), and Co(II), and analyzed with the modified Stern-Volmer model. With Ni (II) representing an exception with Aus = 22 % and log K = 6,5, the other metal ions showed only low fluorescence quenching and low affinity to form a complex, such that the determination of Cu(II) is not affected. In further experiments, fluorescence quenching of the probe by Cu(II) was studied with SMFS, which allows to determine reaction rates for single complexes. The probes were immobilized on a glass surface, and their fluorescence was recorded with a confocal microscope individually one after another. For the first time, individual consecutive association and dissociation events of the coordination of copper(II) to dcbpy were observed in real-time. The events were distinguished by repeated fluctuations of fluorescence intensity between two levels, indicating the formation of the complex with lower quantum yield and subsequent dissociation to the unquenched probe with higher quantum yield. Both the probes labeled with TMR and with Atto620 showed fluorescence quenching upon binding of Cu(II), with fluorescence diminished by ~ 90 % and ~ 66 %, respectively. These results agree very well with ensemble spectroscopy. The kinetic rates of association and dissociation were determined by applying a fluorescence count rate threshold and sorting the durations in the low or accordingly high fluorescent state into a histogram and fitting the data to an exponential model. As the time resolution of this analysis method is limited to the integration time necessary to discriminate between the observed intensity levels, further methods were applied: fluorescence intensity autocorrelation and an automated algorithm based on a Hidden Markov Model (HMM). Both methods revealed an additional kinetic with on- and off-states of few milliseconds that occurred irregularly. With the assumption of a three-state model, the HMM-based method was able to determine the kinetic parameters for the fluctuations corresponding to the association and dissociation events as well as the fluctuations on the faster time scale. Yet, the origin of the fast fluctuation remains left for future studies. In this work two main projects have been realized: First, the development of a fluorescent probe to study simple chemical reactions as a basis for future research of more complex systems, e.g. metal-complex catalyzed reactions. Second, the development and automization of analytical methods for fluorescence fluctuations, allowing the determination of kinetic rates with SMFS. In the present work, the developed methods were applied in studies of the kinetics of complex formation and dissociation between Cu(II) and a bipyridine derivative in thermodynamic equilibrium.

Document type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Professor Jürgen
Date of thesis defense: 27 June 2008
Date Deposited: 11 Jul 2008 09:46
Date: 2008
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
DDC-classification: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Einzelmolekülspektroskopie
Uncontrolled Keywords: Metallkomplex , Kinetik , Fluoreszenzlöschung , Kupfer(II)bipyridin , Metallionensensormetal complex , kinetic , single molecule spectroscopy , fluorescence quenching , metal ion sensor
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