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Locus specific analysis of PcG/TrxG proteins using Bio-tagging technology

Monqaut, Ana Laura

German Title: Locus spezifische Analyse von PcG/TrxG-Proteinkomplexen durch Biotin-Affinitätsaufreinigung

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Abstract

Locus specific analysis of PcG/TrxG using Bio-tagging technology During development many cell types are generated by specific transcription programs that involve activation of gene expression at the level of promoters, enhancers and transcription factors. The identities of these different cell types are characterized by distinct sets of active and inactive genes, and need to be maintained through cell division. To achieve this, the cell type specific expression pattern has to be stably transmitted to the daughter cells. Epigenetic “cellular memory” mechanisms are often involved. In eukaryotes several chromatin-associated protein complexes have been identified, one of these systems comprises the Polycomb group (PcG) and the trithorax group (trxG) complexes. These widely conserved proteins act by locally modifying chromatin to maintain the transcriptional status of their target genes. The PcG and trxG bind as multi-protein complexes to regulatory elements called PREs (Polycomb response elements) in or near their target genes. A PRE can thus be considered an epigenetic switchable element upon which the PcG and trxG act antagonistically to maintain either silencing (PcG) or activation (trxG). Until now only a few distinct PcG complexes have been biochemically identified, but there is ample in vivo evidence that the composition of the PcG is different at different target genes and in different tissues. In addition, the purified complexes composition varies in some extent at different developmental times and depending on the protocol used for the purification. In all cases, biochemical isolations of complexes were performed using whole Drosophila embryos, Drosophila cell lines or mammalian cell lines; thus the purified complexes represent an average of all complexes at all target genes. Altogether, the memory system seems to be much more complicated than previously thought. Additional factors that come in to action at certain points in development might exist, giving a degree of specificity to Pc/TrxG action. So far, little has been done to establish procedures for the differential isolation and characterization of tissue specific, developmental time specific, or locus specific PcG or TrxG complexes. The aim of this thesis work was to design a system to look at the components of chromatin when still bound to the DNA in a locus, time and tissue specific manner. During this work a four-component system was developed based on the utilization of a protein bait and its binding site in the chromatin to co-purify proteins bound to transgenic PRE, giving locus-specificity to the system. To control time or tissue specificity, the protein bait expression was induced by Gal4. One more level of control was introduced by tagging the bait with a Bio-tag recognized and in vivo biotinylated by an enzyme that is also inducible expressed. All system components were introduced in D. melanogaster flies and the generated system was tested proving to be biologically feasible. When tested for protein purification many methodological problems were encountered that affected the efficiency of the system at various levels. Each problem was confronted separately and many experiments were conducted to find a better solution for each experimental step that would lead to a better output. However, protein pull-downs after system optimization resulted in no quantitative enrichment of PRE bound proteins. Nevertheless, thanks to the characterization and system optimization performed in this work, critical steps for functioning of this type of systems were identified. Alternative solutions to some aspects of the system designed will be based in the future on the findings of this work.

Translation of abstract (German)

Locus spezifische Analyse von PcG/TrxG-Proteinkomplexen durch Biotin-Affinitätsaufreinigung In der Entwicklung eines multizellulären Organismus werden verschiedene Zelltypen durch unterschiedliche Transkriptionsprogramme spezifiziert, die durch das Zusammenwirken von Promotoren, genregulatorischen Elementen und Transkriptionsfaktoren entstehen. Die Identität der Zelltypen wird durch ein spezifisches Genexpressionsmuster definiert und dieses wird über die Zellteilung hinweg an die Tochterzellen weitergegeben. Bei diesem Prozeß des "zellulären Gedächtnisses" spielen epigenetische Mechanismen eine wichtige Rolle. In Eukaryoten wurden verschiedene chromatinbindende Proteinkomplexe identifiziert, insbesondere das System der Polycomb- (PcG) und Trithoraxgruppen (trxG) Proteine. Diese hochkonservierten Proteine sind in der Lage die Expression ihrer Zielgene durch lokale Chromatinmodifikationen zu kontrollieren. Die PcG und trxG Proteine binden als multimere Proteinkomplexe an bestimmte regulatorische Elemente in der Nähe ihrer Zielgene, welche PREs (polycomb regulatory elements) genannt werden. Ein PRE kann demnach als ein epigenetischer Schalter verstanden werden, auf den die PcG und trxG Proteine eine einander entgegengesetzte reprimierende (PcG) bzw. aktivierende (trxG) Wirkung haben. Bisher konnten nur wenige verschiedene PcG Komplexe biochemisch identifiziert werden, aber es konnte mehrfach in vivo gezeigt werden, daß die Zusammensetzung der Proteinkomplexe an PREs sich je nach untersuchtem Zielgen oder -gewebe stark unterscheidet. Außerdem unterschied sich die Zusammensetzung der aufgereinigten Proteinkomplexe je nach verwendeter Aufreinigungsmethode und untersuchtem Zeitpunkt in der Entwicklung. In allen Fällen aber wurden Extrakte aus ganzen Embryonen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster oder Insekten- und Säugetierzellinien verwendet. Daher repräsentieren die identifizierten Komponenten nur den Durchschnitt an Proteinkomplexen, die an die verschiedenen Zielgene gebunden waren. Bisher ist es noch nicht gelungen eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Proteinkomplexe in einer spezifischeren Weise zu isolieren und zu charakterisieren. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Systems zur Untersuchung der Proteinkomposition nativen Chromatins in einer lokus-, zeit- und gewebespezifischen Weise. Hierzu wurde eine Methode aus vier Komponenten entworfen, die die Affinität des Tet Repressors zu seiner Zielsequenz auf der DNA dazu benutzt, die Proteinkomponenten eines spezifischen transgenen PREs aufzureinigen. Die Expression dieses Proteinköders kann nun mit Hilfe des Gal4/UAS Systems gewebe- und zeitabhängig reguliert werden. Ein weitere Regulationsmöglichkeit bestand in der ebenfalls induzierbaren Expression des Enzyms, das den hier verwendeten bio-tag zu Proteinaufreinigung in vivo erkennt und biotinyliert. Alle Komponenten wurden als Transgene in Drosophila melanogaster eingebracht und das so konzipierte System funktionell getestet. Während der Aufreinigung der Proteinkomplexe traten verschiedene methodische Probleme auf, welche die Effizienz des Systems an mehreren Stellen beeinflußten. Jedes Problem wurde separat in einer Serie von Experimenten untersucht, um ein verbessertes Aufreinigungsprotokoll zu entwickeln. Das so optimierte System war trotzdem bisher nicht in der Lage, PRE gebundene Proteinkomplexe in ausreichender Menge spezifisch anzureichern. Dennoch konnten durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zur Optimierung der Methoden die wichtigsten Schritte solcher Aufreinigungssysteme identifiziert werden. Zukünftige Alternativen für einzelne Schritte des hier entwickelten Systems werden auf den Erkenntnissen dieser Arbeit beruhen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Paro, Professor Renato
Date of thesis defense: 8. August 2008
Date Deposited: 15. Aug 2008 10:24
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Chromatin, Taufliege, Biotin, Streptavidin
Uncontrolled Keywords: Protein purification , bio-tagging , Polycomb , Trithorax , Epigenetics , Cellular Memory
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