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Präklinische und klinische Charakterisierung von DNA-Methyltransferase Inhibitoren als Wirkstoffe für die Tumortherapie

Stresemann, Carlo

English Title: Preclinical and clinical characterization of DNA-Methyltransferase inhibitors as drugs for cancer therapy

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Abstract

Veränderte Methylierungsmuster spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebserkrankungen. Insbesondere die Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen ist ein häufiges Ereignis, das die Stilllegung von Genen verursacht. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der DNA-Methyltransferasen (DNMTs) mit DNMT-Inhibitoren zur Reaktivierung von epigenetisch stillgelegten Genen führen kann. Die beiden DNA-Methyltranferase Inhibitoren 5-Azacytidin und Decitabin haben bereits zu einer klinischen Verbesserung in der Behandlung von Myelodysplastischen Syndromen (MDS) geführt. Beide Substanzen wurden von der FDA (Food and Drug Administration) für die Behandlung dieser Erkrankungen zugelassen. Nichtsdestotrotz sind die demethylierenden Eigenschaften dieser Substanzen bisher nicht gut charakterisiert worden. Daher war das Ziel meiner Arbeit die demethylierenden und wachstumsinhibierenden Eigenschaften von DNMT Inhibitoren genauer zu charakterisieren. Für diesen Zweck wurde ihre Wirkung in therapiebezogenen präklinischen Modellsystemen untersucht. Außerdem wurden klinische Proben aus MDS-Patienten analysiert, die mit 5-Azacytidin behandelt wurden. Ich konnte in Zellkulturmodellen zeigen, dass eine Behandlung mit 5-Azacytidin oder mit Decitabin, im Vergleich mit anderen DNMT-Inhibitoren die stärkste Inhibition der DNA-Methylierung zeigte. Überdies war auch die wachstumsinhibierende Wirkung dieser Substanzen am stärksten ausgeprägt. In weiteren Experimenten wurde die Rolle von Transporterproteinen für die inhibitorischen Wirkungen der Azanukleoside untersucht. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen ergaben, dass die erleichterte Aufnahme von 5-Azacytidin und Decitabin in einer erhöhten Sensitivität gegenüber den demethylierenden und wachstumsinhibierenden Wirkungen dieser DNMT Inhibitoren resultierte. Ein wichtiger Aspekt für die klinische Charakterisierung von DNMT Inhibitoren war die Analyse der Methylierungsveränderungen in MDS-Patienten. Die Methylierungsuntersuchung von Blut und Knochenmarksproben aus MDS-Patienten, die mit 5-Azazcytidin behandelt wurden, ergab erhebliche Unterschiede in der DNA-Demethylierung zwischen individuellen Patienten. In drei von sechs Patienten konnte eine signifikante und transiente genomweite DNA-Demethylierung nachgewiesen werden. Eine detaillierte Array-basierte Analyse ergab, dass viele hypermethylierte Einzelgene demethyliert werden konnten. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigten leukämische Krebszellen bemerkenswerte Unterschiede in der durch die Behandlung induzierten Verringerung der DNA-Methyltransferasen. Diese Verringerung korreliert jeweils mit den beobachteten Methylierungs-änderungen in den jeweiligen Zelllinien. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein wichtiger Nachweis der demethylierenden Aktivität von 5-Azacytidin in MDS Patienten erbracht werden. Zusätzlich konnte die Existenz von zuvor unbekannten Faktoren aufgedeckt werden, die die Wirkungen von DNMT Inhibitoren beeinflussen.

Translation of abstract (English)

Aberrant DNA hypermethylation patterns play an important role in the pathogenesis of cancer. In particular, the methylation of tumor suppressor genes is a common event which often results in gene silencing. It has been shown that the inhibition of DNA methyltranferases (DNMTs) with DNMT inhibitors can lead to the reactivation of epigenetically silenced genes. The DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and decitabine already have shown significant clinical benefits in the treatment of myelodysplastic syndromes (MDS) and have received FDA approval for this indication. Nevertheless drug-induced DNA methylation changes have remained poorly characterized. Therefore the aim of my work was to characterize demethylating and growth inhibiting effects of DNMT inhibitors. For this purpose I used therapy-related preclinical model systems and clinical samples from MDS patients undergoing azacytidine therapy. In cellular model systems I could show that, in comparison to other DNMT inhibitors, treatment with 5-azacytidine or decitabine resulted in the strongest inhibition of DNA methylation combined with the most significant effects on cancer cell growth. In an additional set of experiments I could characterize the role of transport proteins in the inhibitory effects of these drugs. These results showed that facilitated import of 5-azacytidine or decitabine resulted in a significant sensitization of the cells towards the demethylating and growth inhibiting effects of these DNMT inhibitors. An important part for the clinical characterization of DNMT inhibitors was the analysis of methylation changes in MDS patients. DNA methylation analysis of blood and bone marrow samples from MDS patients undergoing azacytidine therapy revealed substantial differences in the epigenetic responses of individual patients. Significant, transient genomic DNA demethylation could be observed in three out of six patients. A detailed array-based analysis revealed that many hypermethylated genes could be demethylated. In agreement to these results, leukemic cell lines showed remarkable differences in the drug-induced depletion of DNA methyltransferases that coincided with their demethylation responses. Taken together, this work provides important proof of mechanism data for the demethylating activity of azacytidine in MDS patients. Additionally the results of this work clearly reveal the existence of previously unknown modulating factors which influence the effects of DNMT inhibitors.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Gissmann, Prof. Lutz
Date of thesis defense: 25. August 2008
Date Deposited: 01. Sep 2008 08:18
Date: 2008
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: DNS-Methyltransferase, Epigenetik, Myelodysplastisches Syndrom
Uncontrolled Keywords: 5-AzacytidinDNA-Methyltransferase , Epigenetic , Myelodysplastic Syndromes , 5-Azacytidine
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