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Mechanical stimulation of cells : Dynamic behavior of cells on cyclical stretched substrates

Jungbauer, Simon

German Title: Mechanische Stimulierung von Zellen : Dynamisches Verhalten von Zellen auf zyklisch gedehnten Substraten

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Abstract

Besides the biochemical factors in the environment, physical factors can also influence biological processes in tissues or in single cells. For, example the mechanical stimulation of cells can regulate their proliferation, apoptosis or the expression of genes within them. Previous studies concerning the influence of cyclical strain on cells adhering to flexible substrates showed that the cells attempt to reorient themselves to be perpendicular to the stretch direction. This behavior has been described qualitatively, but no systematic, quantitative studies of this phenomenon have yet been undertaken. Furthermore, the cells were only observed prior to and following stretch. Studies of cellular dynamics during the cyclical stretch are lacking. In the present study, our aim was to both observe and quantitatively describe the dynamics of the cellular reaction by means of a biophysical model. We therefore developed a new stretching system which allows live-cell observations during the stretching experiments. The behavior of different cell types was investigated, according to a variety of different parameters such as stretching frequency, stretching amplitude, or cell density. As a model system, we used two types of fibroblasts: rat embryonic fibroblasts (REF52) and primary human fibroblasts (HDF) taken from donors of various ages. We observed that the perpendicular reorientation of the cells occurs at an exponential rate over time. Accordingly, we employed a simple mathematical model to determine how long it characteristically took for the cells to reorient themselves in response to the various mechanical parameters. Our results demonstrated a previously unknown characteristic biphasic cellular behavior which depended on the stretching frequency. Both REF52 and HDF fibroblasts were found to reorient faster, until a certain threshold frequency was reached. In this regime the characteristic reorientation time decreased by a power law, as the frequency increased (characteristic time ~ fn). Above this threshold frequency, the characteristic time ceased to decrease. When the cells were stretched with higher frequencies than this threshold frequency, a saturation of the characteristic time was reached. All tested cell types displayed this biphasic behavior. Cell-specific differences, however, were observed in the reaction kinetics and in the threshold frequencies. The REF52 cells already began to react at a frequency which is approximately 10 times lower compared to the HDF1 cells, in general they reoriented themselves faster than the HDF1 cells at all frequencies. Furthermore, we demonstrated that older HDF cells reoriented themselves faster than young HDF cells. When we increased the cell density to a confluent cell layer, we also observed a power law dependent decrease in the characteristic reorientation time, when the frequency increased. Compared with the single cells, however, a plateau of saturation of the characteristic reorientation time could not be observed. Furthermore, the confluent cells reacted approximately twice as fast as the single cells. Activation of cell-cell contacts involved in mechanotransduction in addition to focal contacts may constitute one possible explanation for this observation. When the stretching amplitude was varied, the characteristic reorientation time was found to decrease, along with an increase in amplitude. However, in contrast to the frequency variation, in this case we observed a linear decrease. The different reaction characteristics resulting from variations in the stretch frequency and the stretch amplitude (power law-dependent and linear) suggested that the inserted energy, the reorientation process depends on can not be described as a simple product of frequency and amplitude. Fluorescence microscopy was used to observe the dynamics of focal adhesion contacts during cyclical stretch. We determined that focal adhesions reoriented themselves faster, compared to the entire cell. Our investigations showed for the first time the reaction dynamics of cells during cyclical mechanical stretch. We thereby determined an interesting general reaction characteristic which was found to be dependent on the stretch frequency, and involved cell-specific thresholds. The molecular mechanisms underlying these observations will be further investigated in future studies.

Translation of abstract (German)

Neben biochemischen Faktoren in der Zellumgebung, können insbesondere auch physikalische Signale, biologische Prozesse in Geweben und einzelnen Zellen beeinflussen und regulieren. So kann zum Beispiel die mechanische Stimulierung von Zellen, deren Proliferation, Apoptose oder das Anschalten von bestimmten genetischen Programmen steuern. Es wurden schon Studien über den Einfluss von zyklischem Dehnen auf Zellen gemacht. Hierzu wurden Zellen auf eine flexible Kunststoffmembranen gesetzt und beobachtet, dass die Zellen versuchen sich, senkrecht zur Zugrichtung anzuordnen. Da dieses Verhalten bisher nur qualitativ beschrieben wurde, gibt es noch keine quantitativen und systematischen Untersuchungen zu diesem Verhalten. Des Weiteren wurden die Zellen nur vor und nach einer bestimmten Zugzeit beobachtet. Die Dynamik der zellulären Reaktion auf das zyklische Dehnen wurde noch nicht untersucht. In dieser Arbeit soll eben diese Dynamik der Zellen beobachtet und anhand von biophysikalischen Modellen quantitativ untersucht werden. Dafür musste ein neues Zugsystem entwickelt werden, das es ermöglicht die Zellen lebendig, während des Zugvorgangs zu beobachten. Das Verhalten verschiedener Zelltypen wurde dann unter Veränderung verschiedener Parametern wie Zugfrequenz, Zugamplitude oder Zelldichte beobachtet. Als Modellsystem wurden verschiedene Fibroblastentypen gewählt, embryonale Fibroblasten von Ratten (REF52) und primäre Fibroblasten (HDF) von jungen und alten menschlichen Spendern. Wir konnten feststellen, dass sich die Zellen im zeitlichen Verlauf exponentiell senkrecht zur Zugrichtung orientieren. Mit Hilfe eines einfachen mathematischen Modells konnten wir die charakteristischen Zeiten für die Umorientierung der Zellen bestimmen und vergleichen. Die Frequenzabhängikeitsstudien zeigten ein bisher unbekanntes biphasisches Reaktionsverhalten. Sowohl REF52 als auch menschliche Fibroblasten orientieren sich bis zu einer gewissen Grenzfrequenz schneller mit einer Zunahme der Zugfrequenz. In dieser Phase nimmt die Zeit für die Umorganisation der Zellen bei steigender Zugfrequenz mit einem Potenzgesetz ab. Überschreitet man die Grenzfrequenz bleibt die Umorientierungszeit nahezu konstant. In dieser Phase tritt eine Sättigung der Zellreaktion ein. Alle getesteten Zelltypen zeigten das gleiche charakteristische, biphasische Verhalten. Unterschiede zeigten sich jedoch in der Reaktionskinetik und der Grenzfrequenz der Zellen. So zeigten die REF52-Zellen schon bei einer etwa 10-fach niedrigeren Frequenz eine Reaktion und generell konnten wir eine schnellere Umorientierung der REF52 Zellen bei allen Frequenzen beobachten, verglichen mit den HDF1 Zellen. Außerdem organisierten sich Zellen von älteren Spendern schneller um als von jungen Spendern. Eine Erhöhung der Zelldichte, so dass anstatt Einzel-Zellen eine konfluente Zellschicht zu beobachten ist, hat gezeigt, dass die charakteristischen Zeiten für die Umorientierung mit Zunahme der Frequenz mit einem Potenzgesetzt abnehmen, jedoch im Gegensatz zu den Einzel-Zell-Beobachtungen kein Sättigungsplateau annehmen. Außerdem reagieren die konfluenten Zellen ungefähr um einen Faktor zwei schneller als einzelne Zellen. Hierbei kann die Aktivierung von Zell-Zell Kontakten, zusätzlich zu den fokalen Kontakten, in der Mechanotransduktion eine Rolle spielen. Bei Veränderung der Zug-Amplitude orientieren sich die Zellen mit Erhöhung der Amplitude schneller um. Allerdings konnten wir hierbei eine lineare Abhängigkeit und keine Potentzgesetz-Abhängigkeit beobachten. Die bei Frequenz- und Amplitudenänderung unterschiedliche Reaktionscharakteristiken (mit einem Potenzgesetz, sowie linear), deuten darauf hin, dass die Energie, von der der Umorientierung abhängt, nicht einfach als Produkt aus Geschwindigkeit des mechanischen Reizes (Frequenz) und der Zugamplitude beschrieben werden kann. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie konnten Fokale Adhäsionskontakte während des Ziehens verfolgt werden und die Dynamik der mechanisch induzierten Umorganisation untersucht werden. Wir haben festgestellt, dass der Umorientierung der Zelle ein Umorientieren der Fokalen Adhäsionskontakte voraus geht. Zusammenfassend konnte mit den Untersuchungen erstmals die Reaktionsdynamik der Zellen auf zyklisches mechanisches Stimulieren bestimmt werden. Dabei wurden interessante allgemeine Reaktionscharakteristiken und spezifische Schwellenwerte festgestellt, deren molekularen Ursachen durch weitere Arbeiten bestimmt werden müssen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Pollerberg, Prof.Dr. G. Elisabeth
Date of thesis defense: 2 June 2008
Date Deposited: 27 Oct 2008 14:54
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > Centre for Organismal Studies Heidelberg (COS)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: Cell Mechanics , Cell Modelling , Cell Orientation , Cell Stretching , Mechanotransduction
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