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Analysis of the Conformational Dynamics of Hsp70 and Hsp90 Chaperones

Graf, Christian

German Title: Analyse der Konformationsdynamik von Hsp70 und Hsp90 Chaperonen

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Abstract

Molecular chaperones of the Hsp70 and Hsp90 family are central components in protein folding processes in the cell. In addition to their general chaperone function in protein quality control, Hsp70 and Hsp90 cooperate in the control of stability and activity of some 200 natively folded clients including receptors, protein kinases and transcription factors, many of which are key regulators in essential signal transduction pathways. Both chaperones are multi-domain proteins that use ATP-controlled cycles for substrate binding and release which are regulated by co-chaperones. The aim of this thesis was to elucidate the allosteric mechanism of Hsp70 and Hsp90 chaperones and their interactions with the co-chaperone CHIP by investigating their conformational changes and dynamics in solution. These conformational studies were performed primarily using amide hydrogen exchange (HX) combined with high-resolution mass spectrometry (MS) and fluorescence spectroscopy. HX-MS experiments with the E. coli Hsp70 homologue DnaK revealed specific ATP-induced conformational changes. Upon ATP binding, the nucleotide-binding domain was more compact, while the substrate binding domain was more flexible. The exposed interdomain linker became completely protected from solvent upon ATP binding. Comparison of the dynamics of the full-length protein with the dynamics of the isolated domains demonstrated a mutual stabilization of both domains. Substrate binding to DnaK in the ATP-bound state reverses the ATP-induced conformational changes in the linker and selected parts of the NBD. The HX-MS data outline a pathway for allosteric interdomain communication which mediates ATP-induced opening of the substrate binding pocket and the substrate-induced stimulation of ATP hydrolysis. Continuous-labeling and pulse-labeling HX-MS experiments with the dimeric E. coli Hsp90 homologue HtpG demonstrate drastic ATP-induced conformational changes throughout the protein that do not occur simultaneously but progress slowly like a wave from the nucleotide binding site towards the N-terminus and the middle domain. A conformation-sensitive fluorescent probe allowed the elucidation of the kinetics of the ATPase cycle of HtpG. Conversion into a compact conformational state was shown to be rate-limiting for ATP hydrolysis and the nucleotide-coordinating residue Glu34 was important for the rate of conversion.Analysis of the conformational dynamics of the eukaryotic Hsp90 homologues from yeast and human, Hsc82 and Hsp90b, by HX-MS revealed a significant higher flexibility as compared to the prokaryotic HtpG. Segments with higher dynamics were located predominantly in the middle and the dimerization domains. Nucleotide binding had long-range effects on the conformation of all domains, but these were more subtle compared to HtpG. Consistent with the hypothesis that conformational dynamics of Hsp90 is linked to regulation by co-chaperones, it could be shown by fluorescence resonance energy transfer experiments with fluorescent Hsp90b; that the binding of the co-chaperone p23 in presence of ATP leads to movement of the N-terminal Hsp90 domains towards each other. Two Hsp90 inhibitors competitive for nucleotide affected the conformational dynamics of Hsp90b differently from nucleotides and from each other. The human E3-ubiquitin ligase CHIP exhibited an extraordinary flexibility with an almost completely unfolded N-terminal TPR domain as measured by HX-MS. Complex formation with intact Hsp70 and Hsp90 or their respective C-terminal octapeptides induced folding of the TPR domain to a defined, stabilized structure. Interaction of CHIP with two different E2 ubiquitin-conjugating enzymes, UbcH5a and Ubc13, resulted in distinct effects on the conformational dynamics of CHIP suggesting different roles of the CHIP-E2 interaction for the ubiquitination of substrates.

Translation of abstract (German)

Molekulare Chaperone der Hsp70 und Hsp90 Familie sind an einer Vielzahl von zellulären Proteinfaltungsprozessen beteiligt. Neben der allgemeinen Chaperon-Funktion in der Proteinqualitätskontrolle spielen Hsp70 und Hsp90 eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Stabilität und Aktivität von über 200 nativ gefalteten Substraten, darunter Rezeptoren, Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren, von denen viele Schlüsselproteine wichtiger Signaltransduktionswege sind. Beide Chaperone sind Multi-Domänproteine, die ihre Substrate in ATP-kontrollierten Reaktionszyklen binden und wieder freisetzen, und dabei zusätzlich durch Co-Chaperone reguliert werden. Ziel dieser Arbeit war es, die allosterische Funktionsweise von Hsp70 und Hsp90 Chaperonen und deren Interaktion mit dem Co-Chaperon CHIP durch die Untersuchung ihrer Konformationsdynamik und ihrer Konformationsänderungen in Lösung aufzuklären. Diese strukturellen Untersuchungen wurden hauptsächlich mit Wasserstoff-H/D-Austausch (HX) in Verbindung mit hochauflösender Massenspektrometrie (MS) sowie Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt. Durch HX-MS Experimente mit Hsp70 aus Escherichia coli, DnaK, konnten spezifische ATP-abhängige Konformationsänderungen in beiden funktionellen Domänen des Proteins nachgewiesen werden: die Nukleotidbindedomäne wird durch ATP-Bindung kompakter, während es in der Substratbindedomäne zu einer Öffnung kommt. Der exponierte Linker zwischen beiden Domänen wird in Gegenwart von ATP stark von der austauschenden Umgebung geschützt. Durch den Vergleich der Konformationsdynamik des Volllängenproteins mit den isolierten Domänen konnte eine wechselseitige Stabilisierung der Domänen gezeigt werden. Die Bindung von Substratpeptid an ein DnaK im ATP gebundenen Zustand führt zu einer Umkehrung der ATP-induzierten Konformationsänderungen im Linker und in Segmenten der Nukleotid-bindedomäne. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen somit die Signalwege der allosterischen Domänen-Kommunikation von Hsp70, durch die einerseits die ATP induzierte Öffnung der Substratbindetasche bewirkt wird und andererseits die ATP-Hydrolyse durch Substratbindung stimuliert wird. Mithilfe kontinuierlicher und gepulster HX-MS Messungen mit dem dimeren Hsp90 Homolog aus Escherichia coli, HtpG, konnten starke ATP-induzierte Konformationsänderungen im gesamten Protein beobachtet werden, die allerdings nicht konzertiert ablaufen, sondern sich langsam und schrittweise wie eine Welle von der unmittelbaren Nukleotidbindestelle zum N-terminalen Ende und zur Mitteldomäne des Proteins ausbreiten. Ein konformationsempfindlicher Fluorophor gekoppelt an HtpG konnte zur Bestimmung der Kinetiken des gesamten ATP-Reaktionszyklus verwendet werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Übergang zu einer stabilisierten Konformation geschwindigkeitsbestimmend für die ATP Hydrolyse ist und dass dabei die Aminosäure Glu34 wichtig für diesen Konformationsübergang ist. Die Analyse der Konformationsdynamik der eukaryotischen Hsp90 Homologen, dem Hsp90b des Menschen und Hsc82 aus Hefe, zeigte eine signifikant höhere Flexibilität im Vergleich zum prokaryotischen HtpG. Die meisten Bereiche mit höherer Dynamik befanden sich in der Mitteldomäne und in der Dimerisierungsdomäne. Nukleotidbindung führte in allen Hsp90-Domänen zu Konformationseffekten, die allerdings erheblich schwächer waren als in HtpG. Mithilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Messungen konnte indes gezeigt werden, dass die Bindung des Co-Chaperons p23 an fluoreszenzmarkiertem Hsp90 in Gegenwart von ATP zu einer Bewegung der N-terminalen Domänen zueinander führt. Die Bindung von zwei mit ATP kompetitiven Hsp90 Inhibitoren beeinflusste die Dynamik von Hsp90b in einer von Nukleotiden verschiedenen Weise. HX-MS Experimente mit der E3-Ubiquitin-Ligase CHIP zeigten, dass das Protein eine außerordentlich hohe Dynamik mit stark entfalteten Bereichen in der N-terminalen TPR Domäne aufweist. Durch Komplexbildung mit intaktem Hsp70 und Hsp90 oder deren C terminalen Oktapeptiden konnte die Faltung der TPR-Domäne zu einer stabilisierten Konformation induziert werden. Die Interaktion mit zwei E2-Ubiquitin-verknüpfenden Enzymen, UbcH5a und Ubc13, führte zu unterschiedlichen Effekten auf die Konformationsdynamik von CHIP und weist damit auf eine spezifische Rolle der E2 CHIP Interaktion für die Ubiquitinierung von Substraten hin.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Mayer, Dr. PD Matthias
Date of thesis defense: 19. June 2008
Date Deposited: 25. Sep 2008 08:44
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > Center for Molecular Biology Heidelberg
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Hitzeschock-Proteine, Massenspektrometrie, Konformationsänderung, Fluoreszenzspektroskopie
Uncontrolled Keywords: H/D-Austausch , Hsp70 , Hsp90 , Co-Chaperonhydrogen exchange , mass spectrometry , Hsp70 , Hsp90 , fluorescence spectroscopy
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