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The focal adhesion protein zyxin mediates wall tension-induced signalling in vascular cells

Wójtowicz, Agnieszka

German Title: Das fokale Adhäsionsprotein Zyxin vermittelt wandspannungsinduzierter Signaltransduktion in vaskulären Zellen

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Abstract

Hypertrophy in conduit and hyperplasia in resistance-sized arteries is the clinically visible outcome of a supra-physiological pressure-induced stretching of endothelial and smooth muscle cells, e.g. in arterial hypertension. This adaptive remodelling of the vessel wall in response to mechanical overload results in the fixation of vascular resistance at devoted levels and, therefore, is a major contributor to coronary heart disease, dilated cardiomyopathy and stroke. Although phenomenologically characterized in detail, the signal transduction pathways underlying the stretchinduced shift in vascular gene expression and, consecutively, long-term phenotype changes of endothelial as well as smooth muscle cells are still poorly understood. In this thesis, the first specifically mechanotransducing protein in endothelial cells could be defined with the focal adhesion protein zyxin. Moreover, it could be shown that zyxin after nuclear translocation orchestrates stretch-induced gene expression in a highly complex way. By comparing isolated perfused arteries from wild type and zyxin-deficient mice, it could be further demonstrated that zyxin plays a decesive role in maintaining vascular structure and function under conditions of high perfusion pressure. Supra-physiological levels of stretch caused a dissociation of zyxin from focal adhesions in endothelial cells. This event was mediated by the consecutive stretchinduced release and coordinated action of endothelin-1 (ET-1) and atrial natriuretic peptide (ANP). The ET-1-mediated release of ANP resulted in a presumably A-type natriuretic peptide receptor-mediated, cGMP-induced activation of protein kinase G, which in turn phosphorylated zyxin, thereby facilitating its dissociation from the focal adhesions and accumulation in the nucleus. This complex stretch-induced signalling cascade described herein for the first time for endothelial cells, closely resembles the multi-cellular events preceding the cardiac release of ANP. Thus, endothelial cells are not only able to sense stretch, but also specifically transduce and respond to mechanical overload by activating the newly characterized mechanotransducer zyxin. Moreover, the first systematic genome-wide microarray analysis of human endothelial and mouse vascular smooth muscle cells revealed a highly complex – albeit similar – response of these cells to mechanical overload. Against the background of the long known effects of chronic stretch in the arterial system, namely hypertension, the microarray results obtained are highly suggestive. In both cell types, more than 600 gene products were differentially expressed in response to cyclic stretch. These could be grouped into in several well-defined cellular pathways that are known to be crucial for the development of hypertrophy and/or hyperplasia in the course of vascular remodelling. Most interesting, a parallel microarray analysis comparing zyxindeficient stretched endothelial and smooth muscle cells with their zyxin-expressing counterparts revealed that zyxin is fundamental for the changes in gene expression preceding stretch-induced vascular remodelling processes. Zyxin suppression would thus result in the inhibition of pro-hypertrophic pathways, e.g. by a shift towards proapoptotic gene expression, but also may affect signalling pathways involved in normal vascular function. Finally, by using freshly isolated perfused segments of the mouse femoral artery from wild type and zyxin-deficient mice, it could be demonstrated that vascular function depends on the presence of zyxin. Although the phenotype of zyxin-deficient mice is mild in young animals, vascular function and structure is strongly impaired in aged mice. Vasoconstriction and, thus, the ability for the regulation of flow resistance, is strongly diminished in zyxin-deficient animals. This effect most probably occurs due to missing zyxin-induced expression. The crucial function of zyxin in vascular physiology could be further substantiated by initial experiments employing the DOCA-salt hypertension model in wild type and zyxin-deficient mice. In conclusion, besides thoroughly analyzing stretch-induced zyxin signalling and gene expression in vascular cells, this thesis provides some interesting insights into the pathophysiological relevance of this molecule, which in the future may be decisive to develop novel therapeutic strategies against hypertension-induced alterations in vascular structure and function.

Translation of abstract (German)

Hypertrophie in arteriellen Leitungsgefäßen und Hyperplasie in Widerstandsgefäßen sind die klinisch fassbaren Resultate lang anhaltender supra-physiologischer druckinduzierter Deformation von Endothel- und glatten Muskelzellen. Dieser die Gefäßwand an die mechanische Überlast anpassende strukturelle Umbau, der zum Beispiel bei Patienten mit arterieller Hypertonie beobachtet wird, führt jedoch zu einer Fixierung des peripheren Flusswiderstandes auf hohem Niveau und trägt hierdurch bei betroffenen Patienten wesentlich zur Entwicklung von Erkrankungen wie der koronaren Herzkrankheit, der dilatativen Kardiomyophatie oder des Schlaganfalls bei. Obwohl der druckinduzierte Gefäßwandumbau phänomenologisch bis ins Detail beschrieben ist, sind die molekularen Mechanismen, angefangen bei den druckinduzierten Änderungen des vaskulären Transkriptoms bis zu den stabilen Phänotypänderungen der betroffenen Gefäßzellen noch immer kaum untersucht. In dieser Arbeit konnte mit dem zytoskelettalen Protein Zyxin das erste Protein charakterisiert werden, das spezifisch die intrazelluläre Transduktion mechanischer Reize, in diesem Falle Wandspannungsänderungen, leistet. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Zyxin wesentlich an den komplexen Änderungen der Genexpression betroffener Zellen beteiligt ist. Schließlich konnte durch die vergleichende Analyse von isoliert perfundierten Arterien aus Wildtyp- und zyxin-defizienten Mäusen (KO-Mäusen) gezeigt werden, dass Zyxin, insbesondere unter Bedingungen erhöhten Perfusionsdrucks, tatsächlich in situ und in vivo eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der arteriellen Funktion spielt. Im Einzelnen konnten folgende Ergebnisse erzielt werden. Eine andauernde Erhöhung der Wandspannung führte in Endothelzellen zu einer Dissoziation von Zyxin aus fokalen Adhäsionspunkten und einer Akkumulation des Proteins im Zellkern. Die komplexe intra- und extrazelluläre Signalkette die schließlich durch eine Phosphorylierung von Zyxin erst diese Translokation auslöste konnte hier erstmals beschrieben und auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Außerdem konnten durch die ersten systematisch vergleichenden genomweiten Untersuchungen der wandspannungsinduzierten Genexpression in Endothelzellen und glatten Gefäßmuskelzellen mit Hilfe der Mikroarray-Technik (i) die komplexen Änderungen des zellulären Transkriptoms bei mechanischer Überlast charakterisiert werden und (ii) durch den vergleichenden Gebrauch von Zellen mit verminderter/fehlender Zyxinexpression die komplexe Rolle von Zyxin hierbei analysiert werden. Insgesamt wurden in beiden Zelltypen jeweils mehr als 600 Genprodukte differentiell durch Erhöhung der Wandspannung reguliert; hervorzuheben ist hierbei, dass diese Änderungen trotz wichtiger zelltypspezifischer Unterschiede insbesondere was die zyxinabhängige Genexpression angeht sehr ähnlich waren. Praktisch alle differentiell exprimierten Genprodukte konnten in verschiedene funktionell gut charakterisierte Gruppen sortiert werden. Neben in diesem Kontext neuen und überraschenden Zusammenhängen konnten sehr viele dieser Genprodukte Pathways zugeordnet werden, deren Bedeutung in der Hypertonie und im druckinduzierten Gefäßwandumbau bereits bekannt ist. Die Rolle von Zyxin wurde parallel in untersucht: Fast der Hälfte aller differentiell exprimierten Genprodukte war von Zyxin abhängig; dies galt insbesondere für Genprodukte die wichtig für die Proliferation, das Überleben der Zellen und den Zelltod sind. Ein Verlust der Funktion von Zyxin unter Bedingungen der mechanischen Überlast würde somit insgesamt zu einer verminderten pro-hypertrophen/-hyperplastischen Genexpression führen. Schließlich konnte in frisch isolierten perfundierten Segmenten der Femoralarterie aus Wildtyp und zyxindefizienten Mäusen gezeigt werden, dass neben der Signaltransduktion bei mechanischer Überlast Zyxin auch eine wesentliche Rolle bei der arteriellen Funktion unter physiologischen Bedingungen spielt. So können Arterien aus zyxindefizienten Tieren nicht adäquat auf wichtige vasoaktive Mediatoren wie Endothelin-1, Azetylcholin oder Adrenalin reagieren und besitzen eine instabile Struktur, insbesondere der Tunica media. Diese Effekte sind vor allem in älteren Tieren und ihren Blutgefäßen zu beobachten während jüngere Tiere einen milden Phänotyp besitzen. Diese zentrale Rolle von Zyxin bei der vaskulären Homoöstase konnte zusätzlich durch die vergleichende Analyse von Mäusen in einem Hypertoniemodell (DOCA-Salz) belegt werden. So besaßen zyxindefiziente Tiere - übereinstimmend mit der komplexen Funktion von Zyxin - im Vergleich eine schlechte arterielle Compliance und einen niedrigen totalen peripheren Flusswiderstand. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit neben der vollständigen Beschreibung des Mechanismus der wandspannungsinduzierten Aktivierung von Zyxin auch die Funktion des Proteins bei der vaskulären Genexpression und damit beim Beginn des druckinduzierten Gefäßwandumbaus gezeigt werden. Diese Daten könnten in Zukunft entscheidend zur Entwicklung therapeutischer Strategien gegen den druckinduzierten Gefäßwandumbau und seine schweren

Item Type: Dissertation
Supervisor: Felix Prof. Dr., Wieland
Date of thesis defense: 17 September 2008
Date Deposited: 26 Sep 2008 12:43
Date: 2008
Faculties / Institutes: Medizinische Fakultät Heidelberg > Institut fuer Physiologie und Pathophysiologie
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Gefäßwandumbau
Uncontrolled Keywords: Zyxin , Signaltransduktion , Endothelzellen , Gefäßwandumbauzyxin , remodelling , mechanotransduction , vessels , ANP
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