German Title: Die Rolle der Sulfit Reduktase bei der assimilatorischen Sulfatreduktion in Arabidopsis thaliana

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Abstract

Reductive assimilation of inorganic sulfate to sulfide is an essential metabolic process in higher plants for the synthesis of cysteine and all downstream compounds containing reduced sulfur in the cell. Sulfite reductase (SiR) palys a central role in the assimilatory sulfate reduction pathway by catalyzing the reduction of sulfite to sulfide. An Arabidopsis T-DNA insertion line (sir1-1) with an insertion in the promoter region of SiR was isolated in order to address the exact role of SiR in vivo. Detailed characterization of sir1-1 revealed that homozygous sir1-1 plants are viable, but severely affected in growth. Homozygous sir1-1 plants flower and set viable seeds, albeit later than wild-type plants grown under the same conditions. Evaluation of SiR transcript levels in the leaves of sir1-1 plants revealed that the mRNA was down-regulated to about 50% of wild-type level. Consequently, the amount of SiR protein and the SiR activity were reduced in the same manner. The significant differences between the leaves of sir1-1 and Col-0 plants for most of the sulfur-containing and other related compounds such as cysteine, O-acetylserine (OAS), sulfate, nitrate, total glucosinolates, total carbon (C), nitrogen (N), and sulfur (S) suggests strong perturbations in the entire metabolism of sir1-1 plants. A reduction of approximately 25.6-fold and 32.7-fold in the incorporation of 35S label into cysteine and GSH fractions, respectively, of sir1-1 leaves compared to wild-type plants was observed, suggesting the fact that the activity of SiR generates a severe bottleneck in the sulfur assimilation pathway. Investigations of the transcript levels through microarray analysis revealed that the expression of many genes related to sulfur metabolism was altered in response to reduced sulfide synthesis. Out of 920 selected genes related to sulfur metabolism, the expression of 67 genes in the leaves and 180 genes in the roots of sir1-1, were significantly up- or down-regulated compared to wild-type. The high affinity sulfate transporters, sulfate transporter 1;1 (SULTR 1;1) and sulfate transporter 1;2 (SULTR 1;2) showed a significant up-regulation in the roots of sir1-1 compared to Col-0. The up-regulation of the high affinity sulfate transporters in the roots of sir1-1 suggests that instead of steady-state sulfate levels, the amount of reduced sulfur present in the cell, likely forms the signal for their their induction. The preliminary results for a second T-DNA insertion line (sir1-2) strongly indicate that an insertion more closer to the gene, in the promoter region of SiR causes early seedling lethality. All results point towards the exclusiveness of SiR for sufite reduction and that its optimal activity is essential for the normal growth of Arabidopsis plants. Treatment of different Arabidopsis lines with selenate, which is quite similar to sulfate, caused an increase in the total sulfur and selenium contents of the plants. This might happen due to the up-regulation of sulfate transporters which might eventually lead to an increase in total sulfur and selenium due to elevated sulfate/selenate contents.

Translation of abstract (German)

Reduktive Assimilation von anorganischem Sulfat zu Sulfid ist in höheren Pflanzen ein essentieller metabolischer Prozess für die Synthese von Cystein und allen daraus resultierenden Verbindungen mit reduziertem Schwefel in der Zelle. Sulfit Reduktase (SiR) spielt eine zentrale Rolle in der assimilatorischen Sulfatreduktion, indem es die Reduktion von Sulfit zu Sulfid katalysiert. Eine Arabidopsis T-DNA Insertionslinie (sir1-1) mit einer Insertion in der Promotor-Region von SiR wurde isoliert, um die genaue Rolle von SiR in vivo zu untersuchen. Die homozygote sir1-1 Pflanzen waren zwar lebensfähig, aber stark im Wachstum beeinträchtigt. Homozygote sir1-1 Pflanzen blühen und produzieren lebensfähige Samen, wenn auch später als Wildtyp-Pflanzen. Die Ermittlung von SiR Transkriptmengen in Blättern der sir1-1 Pflanzen zeigte, dass die mRNA zu 50 % der Wildtyp-Level herunterreguliert war. Die Menge an SiR Protein sowie die SiR-Aktivität waren entsprechend reduziert. Die signifikanten Unterschiede zwischen Blättern von sir1-1 und Col-0 Pflanzen der meisten schwefelhaltigen und anderen in Beziehung stehenden Verbindungen deuten auf eine starke Störung im gesamten Stoffwechsel von sir1-1 Pflanzen hin. Es wurde eine Reduzierung der Inkorporation von 35S-Markierung von 25,6-fach in Cystein- und 32,7-fach in GSH-Fraktionen in sir1-1 Blättern im Vergleich zum Wildtypen beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass SiR-Aktivität einen schwerwiegenden Engpass im Schwefel-Stoffwechsel darstellt. Microarray-Analysen zeigten, dass die Expression vieler Schwefelstoffwechsel-assoziierter Gene als Antwort auf die reduzierte Sulfid-Synthese geändert war. Von 920 selektierten Schwefelstoffwechsel-assoziierten Genen war die Expression von 67 Genen in Blättern und 180 Genen in Wurzeln von sir1-1 signifikant hoch- oder herunterreguliert im Vergleich zum Wildtypen. Die hochaffinen Sulfattransporter, SULTR 1;1 und SULTR 1;2, zeigten eine signifikante Hochregulierung in den Wurzeln von sir1-1 Pflanzen. Daher stellen wahrscheinlich nicht die steady-state Sulfatgehalte, sondern die Menge von reduziertem Schwefel in der Zelle das Signal für die Induktion der hochaffinen Sulfat-Transporter dar. Die vorläufigen Ergebnisse mit einer zweiten T-DNA Insertionslinie (sir1-2) legen nahe, dass eine Insertion, die in der Promotorregion näher am Gen von SiR liegt, frühe Keimlingslethalität hervorruft. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass SiR das exklusive Enzym für Sulfit-Reduktion ist und dass seine optimale Aktivität für normales Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen essentiell ist. Behandlung von verschiedenen Arabidopsis-Linien mit Selenat, das chemisch dem Sulfat sehr ähnlich ist, verursachte einen Anstieg in den Gesamtgehalten von Schwefel und Selen, was eine folge der Aktivierung der Sulfat-Transporter sein könnte.