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Identification of novel cytosolic thioredoxin-1 target proteins in mammalian cells by mechanism-based kinetic trapping

Weingarten, Lars

German Title: Identifikation neuer cytosolischer Thioredoxin-1 Zielproteine in Säugerzellen durch kinetisches trapping

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Abstract

Reactive oxygen species (ROS) have been reported to be locally produced after stimulation of various transmembrane receptors, including those for cytokines, growth factors and hormones. Transient ROS generation leads to the reversible oxidation of redox-sensitive proteins, which may either result in their transient activation or inactivation. Even though the role of ROS as a signal transducer is widely accepted, little is known about the identity of redox-sensitive proteins and the reduction mechanism by which they are re-generated. Thioredoxin-1 (Trx1) is an oxidoreductase known to influence a variety of cellular processes including proliferation, apoptosis and gene expression. In higher plants and cyanobacteria different proteomic approaches allowed for the identification of various thioredoxin target proteins. However, no comprehensive study of Trx1 interactions in the cytosol of mammalian cells has been performed so far. In this thesis, mechanism-based kinetic trapping was applied to identify proteins forming mixed disulfide intermediates with Trx1 in the cytosol of a human T cell leukemia line. Most previously established target proteins of Trx1 could be identified, including ribonucleotide reductase, peroxiredoxins and annexin-2, thus confirming the validity of the approach. Interestingly, a substantial number of newly identified proteins currently lacks functional annotation, suggesting that several thioredoxin-regulated pathways still await initial characterization. Of those newly identified proteins with known function, a significant portion is associated with cell cycle control and regulation of apoptosis, while others participate in various signal transduction pathways, cytoskeleton and membrane dynamics, metabolism and transcriptional control. These results strongly support the long-held belief that Trx1 not only plays a role in ROS scavenging and reductive metabolism but is also extensively involved in interactions with key regulatory proteins associated with cellular behavior and fate. While Trx1-interactions are clearly pleiotropic in that they affect a variety of processes simultaneously, we have found strong evidence that they are nevertheless highly target specific. The newly identified Trx1 target proteins cdk6 and caspase-2 were selected for further study. For cdk6 the thioredoxin-interacting cysteine residue was identified and for caspase-2 redox regulation of activity by Trx1 could be demonstrated in vitro, lending further support to the biological relevance of Trx-based regulation.

Translation of abstract (German)

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden lokal nach Stimulation verschiedener Transmembranrezeptoren produziert. Die transiente Bildung von ROS bewirkt eine Oxidation redox-sensitiver Proteine, was zu deren Aktivierung oder Inaktivierung führen kann. Trotz der allgemein akzeptierten Rolle von ROS als Botenstoff ist bislang wenig über die Identität und Regeneration oxidations-sensitiver Proteine bekannt. Thioredoxin-1 (Trx1) ist eine reduzierende Thiol-abhängige Oxidoreduktase, die mit zahlreichen zellulären Prozessen, wie z.B. Proliferation, Apoptose und Genexpression in Verbindung steht. In höheren Pflanzen und Cyanobakterien wurden verschiedene Proteom-Analysen zur Identifizierung von Thioredoxin- Zielproteinen erfolgreich angewandt. Entsprechende Studien an Säugerzellen wurden jedoch bislang nicht durchgeführt. Zur Identifizierung von Proteinen die mit Trx1 ein gemischtes Disulfid-Intermediat ausbilden, wurde die sogenannte mechanism-based kinetic trapping Technik auf die humane Jurkat T-Zelllinie angewandt. Dabei konnten bereits bekannte Trx1 Zielproteine wie Ribonukleotid- Reduktase, Peroxiredoxine und Annexin-2 identifiziert werden. Ein nicht unerheblicher Anteil der neu identifizierten Proteine ist bislang ohne funktionelle Zuordnung was auf die Existenz noch nicht charakterisierter redox-sensitiver Signalwege hindeutet. Interessanterweise ist ein signifikanter Anteil der mit Trx1 interagierenden Proteine mit der Regulation von Zellzyklus und Apoptose assoziiert, während andere redox-sensitive Proteine an Signaltransduktion, Zytoskelett- und Membrandynamik, Metabolismus und Transkriptionskontrolle beteiligt sind. Diese Daten unterstützen die lange gehegte Auffassung, dass Trx1 nicht nur eine Rolle bei der Neutralisierung von ROS und im Metabolismus spielt, sondern darüber hinaus intensiv an der Regulation von Signaltransduktion, Zellzyklus und Zelltod beteiligt ist. Die in dieser Arbeit beschriebenen Trx1-Interaktionen sind pleiotrop, in dem Sinne, dass sie eine Vielzahl an zellulären Prozessen betreffen, jedoch zugleich sehr spezifisch für bestimmte Zielproteine. Zur Identifizierung der Cysteine die von Trx1 reduziert werden wurden Mutagenese-Studien am neu gefundenen Trx1 Zielprotein cdk6 durchgeführt. Darüber hinaus konnte eine Regulation der Aktivität von Caspase-2 durch Trx1 in vitro nachgewiesen werden.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Rausch, Prof. Dr. Thomas
Date of thesis defense: 11. December 2008
Date Deposited: 15. Dec 2008 11:09
Date: 2008
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Proteomanalyse, Cytosol, Apoptosis, Zellzyklus
Uncontrolled Keywords: proteomics , cytosol , apoptosis , cell cycle , thioredoxin-1
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