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Post-transcriptional gene regulation in Drosophila : an investigation into the roles of RNA silencing and the DEAD-box helicase Belle

Natalin, Pavel

German Title: Post-Transkriptionelle Genregulation in Drosophila : eine Untersuchung bezüglich der Rollen von RNA Interferenz und der DEAD-box Helikase Belle

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Abstract

Post-transcriptional regulation of gene expression relies on multiple mechanisms to elicit translational control and/or mRNA decay. RNA silencing pathways operate at both stages, targeting a significant fraction of the transcriptome, namely those mRNAs complementary to short interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs). Using Drosophila S2 cells, I have carried out a genome-wide search for transcripts regulated by these pathways. mRNA expression profiles were obtained for cells depleted of AGO1, AGO2, PIWI or Aubergine, members of the Argonaute family of proteins essential for RNA silencing, and analyzed alongside profiles from cells depleted of the miRNA-processing enzyme Drosha. Changes in transcript levels in Drosha-depleted cells correlated closely with those in the AGO1 knockdown, demonstrating that miRNA targets change level following inhibition of the miRNA pathway and supporting the idea that miRNAs can cause degradation of the targeted transcripts, and do not just repress translation as previously thought. Furthermore, it was found that a subset of miRNA targets is also regulated by AGO2; together with evidence that AGO1 and AGO2 silence the expression of a common set of mobile genetic elements, this suggests a degree of functional overlap for AGO1 and AGO2 in the Drosophila RNA silencing pathway. I next focused on the Drosophila protein Belle, a member of the conserved family of DEAD-box RNA helicases. Most members of this protein family exhibit NTPase activity stimulated by or dependent on RNA binding and use the energy derived from NTP hydrolysis to unwind double-stranded RNA or disrupt RNA/protein interactions. Many DEAD-box proteins localize to RNA granules such as maternal and neuronal transport mRNPs, polar granules, and P bodies. Belle is a component of nuage within nurse cells and polar granules within the oocyte. It is an essential protein required for larval growth, as well as male and female fertility, and has a putative role in RNA silencing. I show that Belle is required for cell viability. In cells depleted of Belle, general protein synthesis is inhibited. However, a luciferase mRNA reporter with Belle tethered to the 3′ UTR is translationally repressed without any reduction in mRNA levels. Tethering of Belle to the reporter mRNA induces the formation of heavy mRNP complexes. Translational repression is abolished when Belle contains mutations disrupting the putative helicase activity. Using a biochemical and computational approaches, I found that in Drosophila S2 cells, Belle is part of an interaction network consisting of proteins implicated in general protein synthesis as well as selective translational control mechanisms. Belle interacts with translation initiation factors and ribosomal proteins, supporting the idea that Belle is required for general translation efficiency. However it also associates with translationally regulated mRNAs and proteins involved in mRNA translational control and localization, suggesting that Belle may be implicated in mRNP assembly and transport as well as localized mRNA translation. Finally, I show that Belle interacts with AGO2 and other components of the RISC, suggesting that Belle may function as an auxiliary factor in the RNA silencing pathway.

Translation of abstract (German)

Bei der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression wirken mehrere Mechanismen um die Translation und/oder den mRNA Abbau zu kontrollieren. RNA-Interferenz wirkt auf beiden Ebenen um einen erheblichen Anteil des Transkriptoms zu regulieren; nämlich diejenigen mRNAs, zu welchen es kleine komplementäre short interfering RNAs (siRNAs) und microRNAs (miRNAs) gibt. Um die Transkripte, welche auf diese Art reguliert werden, zu identifizieren, habe ich eine genomweite Suche in Drosophila S2 Zellen durchgeführt. Es wurden mRNA-Expressionsprofile von Zellen erstellt, in welchen Angehörige der für die RNA-Interferenz essentiellen Argonaut-Proteinfamilie (AGO1, AGO2, PIWI oder Aubergine) depletiert waren. Diese wurden mit dem Profil von Drosha-depletierten Zellen verglichen, einem Enzym das die miRNAs prozessiert. Die Veränderungen im Transkriptionsniveau von Drosha-depletierten Zellen korrelierten eng mit jenen von AGO1-depletierten Zellen. Dies zeigt, dass sich nach einer Blockade der miRNA Produktion die Menge der jeweiligen Zieltranskripte ändert, was wiederum die These stützt, dass miRNAs zum Abbau des Zieltranskriptes beitragen, und nicht nur, wie bisher angenommen, dessen Translation unterdrücken. Weiterhin konnten wir belegen, dass eine Untergruppe von miRNA Zieltranskripten auch über AGO2 reguliert wird. Zusammen mit der Tatsache, dass AGO1 und AGO2 die Expression einer allgemeinen Gruppe genetisch mobiler Elemente unterdrücken, deutet dies darauf hin, dass sich die Rollen von AGO1 und AGO2 bei der RNA-Interferenz überlappen. Danach konzentrierten sich meine Untersuchungen auf die DEAD-box RNA-Helikase Belle aus Drosophila. Die meisten Mitglieder dieser Proteinfamilie zeigen NTPase-Aktivität, die abhängt oder stimuliert wird durch die Bindung an RNA. Sie benutzen die durch die NTP-Hydrolyse frei werdende Energie, um doppelsträngige RNA aufzuwinden oder um Wechselwirkungen zwischen RNA und Proteinen zu stören. Viele dieser DEAD-box Proteine finden sich in so genannten RNA Körperchen (RNA granules), wie z.B. den mütterlichen und neuronalen Transporter-mRNPs, den polaren Körperchen (polar bodies) und den prozessierenden Körperchen (P-bodies). Belle ist ein Bestandteil der “Nuage“-(Wolken-) Struktur in Ammenzellen, und der polaren Körperchen in Oozyten. Es ist ein essentiell notwendiges Protein und erforderlich für das Larvenwachstum und für die Fruchtbarkeit bei männlichen sowie weiblichen Fliegen. Darüber hinaus spielt es eine mutmaßliche Rolle in der RNA-Interferenz. Ich konnte zeigen, dass Belle für die Lebensfähigkeit der Zelle erforderlich ist. In Zellen, in welchen Belle depletiert wurde, ist die allgemeine Proteinsynthese gehemmt. Ein Luziferase-mRNA Reporterkonstrukt hingegen, in welchem Belle künstlich an das 3´-UTR Ende gebunden wird bleibt mengenmäßig stabil, während die Translation gehemmt wird. Die Bindung von Belle an die Reporter-RNA führt zur Bildung von schweren mRNP-Komplexen. Belle Proteine mit Mutationen, die die mutmaßliche Helikaseaktivität stören, unterdrücken die Translation nicht. Mit einem kombinierten biochemischen und rechnerischen Ansatz fand ich Belle als Teil eines Interaktionsnetzwerkes, das sowohl Proteine der allgemeinen Proteinbiosynthese enthält, also auch Proteine beinhaltet die an speziellen translationellen Kontrollmechanismen mitwirken. Belle interagiert dabei mit Translationsinitiationsfaktoren und ribosomalen Proteinen, was die Theorie stützt, dass Belle für die Effizienz der allgemeinen Translation notwendig ist. Allerdings assoziiert es auch mit translational regulierten mRNAs und mit Proteinen, welche eine Rolle in der Translationskontrolle und Lokalisation von mRNA spielen. Dies wiederum deutet auf ein Rolle von Belle im Zusammensetzen und Transport von mRNPs und bei der lokalisierten Translation von mRNA. Schlussendlich zeige ich, dass Belle mit AGO2 und weiteren Bestandteilen des so genannten RISC Komplexes interagiert, was darauf hindeutet, dass Belle als zusätzlicher Faktor bei der RNA-Interferenz fungieren könnte.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Izaurralde, Dr. Elisa
Date of thesis defense: 19 December 2008
Date Deposited: 08 Jan 2009 14:47
Date: 2008
Faculties / Institutes: Service facilities > European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Taufliege, Small RNA, RNS-Interferenz, RNS, RNS-Bindungsproteine, Messenger-RNS, Helicase, DEAD-box-Proteine, Ribonucleoproteine
Uncontrolled Keywords: RNA silencing , Translational control
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