German Title: Mikrotubuli-assoziierte Proteine der Spalthefe

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Abstract

The highly conserved Dis1/XMAP215 family of microtubule-associated proteins (MAPs) play a central role in cytoplasmic microtubule organisation and mitotic spindle formation. The fission yeast S. pombe has two family members, Alp14 and Dis1. Both localise to interphase microtubules, spindle pole bodies (the yeast equivalent of the centrosome), and kinetochores. Here we present the characterisation of Alp14 and Dis1 during interphase. We find that Alp14 localisation resembles that of Mal3, a canonical plus end tracking protein. Deletion results in a decrease in the number and length of interphase microtubule bundles at low temperatures. Alp14 is temperature sensitive. At the restrictive temperature we find that an interphasic intranuclear microtubule bundle forms, nucleated from the region of the spindle pole bodies and kinetochores. This intranuclear bundle has a structure and displays dynamics similar to that of a normal interphase bundle and is able to move the nucleus. Dis1 localises to interphase microtubules but does not show plus end tracking behaviour. Deletion has no apparent effect on the organisation of interphase microtubules, but Dis1 is cold sensitive and at the restrictive temperature the cells become blocked in mitosis with aster-like spindles. Deletion of both alp14 and dis1 is lethal. We investigate the functional redundancy between Alp14 and Dis1 during interphase. Over-expression of Dis1 in alp14 deletion cells can partially rescue the mutant microtubule phenotype. Conversely, attenuated expression of Dis1 in an alp14 deletion background results in almost complete loss of interphase microtubules. We conclude that the presence of at least one of the Dis1/XMAP215 homologues is essential for the maintenance of interphase microtubule arrays. Similar to Alp14, Tip1 is a microtubule plus-end tracking protein, homologous to human CLIP170. Together with the EB1 homologue, Mal3, Tip1 spatially regulates microtubule dynamics, ensuring that the cylindrical cell shape of S. pombe is maintained. In the second part of this thesis the characterisation of the protein SPCC736.15 (Toi4), identified in a screen for Tip1-interacting proteins is presented. During interphase, Toi4p-GFP localises to the central regions of the cell cortex. Shortly before mitosis, Toi4p-GFP begins to accumulate at the cell ends. Concurrent with the onset of mitosis, there is exclusion of Toi4p-GFP from the region of the cell cortex where the actomyosin ring forms and the cell subsequently divides. The S. cerevisiae homologue of Toi4p is Pil1p, which is proposed to be the major component of an endocytic organelle termed the eisosome. We tested for such a role for Toi4 in S. pombe, however we detect no link between Toi4 and endocytosis, suggesting that the homologues, although they have a similar localisation pattern, may perform different functions.

Translation of abstract (German)

Die Mitglieder der Dis1/XMAP215 Proteinfamilie gehören zu den Mikrotubuli assoziierten Proteinen (MAPs). Die stark konservierten Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Organisation der Mikrotubuli im Cytoplasma und beim Aufbau der mitotischen Spindel. In der Spalthefe S. pombe gibt es zwei Mitglieder dieser Proteinfamilie, Alp14 und Dis1, die beide auf die Mikrotubuli der Interphase, die Spindelpolkörper (SPB) und die Kinetochoren lokalisieren. In dieser Arbeit werden die Eigenschaften dieser beiden Proteine während der Interphase analysiert und beschrieben. Unsere Untersuchungen haben ergeben, dass die Lokalisierung von Alp14 der von Mal3 ähnelt, das fuer gewöhnlich am wachsenden plus-Ende und im Bereich der minus-Enden der Mikrotubuli sitzt. Die Eliminierung des Proteins durch Gendeletion (alp14del), resultiert, bei niedriger Temperatur, in einer Abnahme der Anzahl und Länge von Interphasenmikrotubuli-Buendeln. Bei erhöhter Temperatur bildet sich trotz Interphase, ein einzelnes Mikrotubuli-Buendel im Zellkern was normalerweise nur in der Mitose geschieht. Dieses intra-nukleäre Buendel entspringt aus der Region von SPB und Kinetochoren. Es ähnelt in seiner Struktur und Dynamik einem cytoplasmatischen Mikrotubuli-Buendel und hat die Fähigkeit, den Zellkern zu verschieben. Dis1 befindet sich während der Interphase ebenfalls an den Mikrotubuli, ist jedoch entlang der gesamten Mikrotubuli verteilt und beschränkt sich nicht auf das plus- und minus-Ende. Die Eliminierung des dis1 Genes hat keinen offensichtlichen Einfluss auf die Organisation der Mikrotubuli in der Interphase. Bei tiefen Temperaturen wird jedoch die Mitose der Zelle blockiert und die Spindeln besitzen abnormale, asterförmige Strukturen. Zellen in denen alp14 und dis1 gleichzeitig eliminiert wurden, sind nicht ueberlebensfaehig. In dieser Arbeit wird die offensichtliche funkionelle Redundanz von Alp14 und Dis1 in der Interphase untersucht. Wird Dis1 in alp14del Zellen ueberexprimiert, so tritt der oben beschriebene Mikrotubulidefekt nicht mehr auf. Im Gegenzug fuehrt eine verminderte Exprimierung von Dis1 in alp14del Zellen zu einem beinahe vollständigen Verlust der Interphasenmikrotubuli. Wir folgern, dass mindestens eines der beiden Proteine fuer die Aufrechterhaltung der Interphasenmikrotubuli unverzichtbar ist. Wie Alp14 ist Tip1 ein Protein, welches sich an den Plus-Enden der Mikrotubuli befindet. Es ist homolog zu humanem CLIP170 und reguliert zusammen mit dem EB1-Homolog Mal3 die Dynamik der Mikrotubuli in Abhängigkeit von ihrer Position. Auf diese Weise wird die Erhaltung der Bipolaritaet der Zelle sicher gestellt. Der zweite Teil dieser Arbeit charakterisiert das Protein SPCC736.15 (Toi4), welches in einem Screen als Interaktionspartner von Tip1 identifiziert werden konnte. Waehrend der Interphase ist Toi4 im zentralen Bereich des Zellkortex lokalisiert, kurz vor Einsetzen der Mitose hingegen, sammelt es sich an den Zellenden. Toi4p-GFP verschwindet an den Stellen im Kortex, wo sich zu Beginn der Mitose der Aktomyosin-Ring ausbildet und anschliessend die Zellteilung stattfindet. Das Protein Pil1p in S. cerevisiae ist homolog zu Toi4p. Pil1p ist eine wichtige Komponente in Eisosomen, welche, so vermutet man, endozytotische Organellen sind. Wir untersuchten Toi4 im Hinblick auf diese Funktion in S. pombe, konnten jedoch keinen Zusammenhang von Toi4 und Endozytose feststellen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Homologe trotz ihrer ähnlichen Lokalisierung unterschiedliche Funktionen erfuellen.