German Title: Molekulare Mechanismen der COPI Vesikelbiogenese

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Abstract

COPI Vesikel sind definiert durch eine Proteinhülle bestehend aus der kleinen GTPase Arf1 und Coatomer. Während der COPI Vesikel Biogenese rekrutiert Arf1-GTP Coatomer an die Membran. Von einer ArfGAP Aktivität katalysierten GTP Hydrolyse revertiert diese Membran Verankerung. In dieser Arbeit wurden die drei oben genannten Schlüsselproteine, Arf1, Coatomer und ArfGAP1 näher charakterisiert, um Aufschlüsse über die molekularen Mechanismen zu erhalten, welche COPI Vesikel Biogenese und Funktion zu Grunde liegen: (i) Wir zeigen in dieser Arbeit, dass Arf1-GTP positive Membran Kurvatur induziert und beobachten, dass die kleine GTPase an Membranen dimerisiert. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen Arf1-Dimerisierung und Membran Kurvatur zu untersuchen, wurde eine Arf1 Mutante isoliert (Arf1-Y35A), welche nicht mehr dimerisieren kann. Obwohl dieses monomere Arf1 noch in der Lage ist der klassischen Rolle von Arf1 als Coatomer Rezeptor nachzukommen, hat es seine Kompetenz zur Vesikelbiogenese verloren, und ist letal in Hefe. Erstaunlicherweise ist diese Mutante auch nicht mehr in der Lage Membranen zu deformieren, was nahe legt, dass GTP-spezifische Dimerisierung von Arf1 ein kritischer Schritt für die Bildung von COPI Vesikeln ist. Unseren Beobachtungen nach trägt Arf1, obwohl die Kurvatur eines knospenden COPI Vesikels von Coatomer hervorgerufen wird, zur Membrandeformation bei, die notwendig für die Abschnürung eines Vesikels ist. (ii) Der heptamere Proteinkomplex Coatomer existiert in vier möglichen Isoformen, welche durch ihre γ1/γ2, ζ1/ζ2 Untereinheiten definiert und differenziell über den Golgi verteilt sind. Im Rahmen diese Arbeit wurde eine biochemische Charakterisierung der vier rekombinant hergestellten Isoformen durchgeführt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass alle vier rekombinanten Komplexe, verglichen mit aus Gewebe gewonnenem Coatomer, eine vergleichbare Effizienz zur Vesikelgenerierung aufweisen. Im Rahmen vorläufiger Ergebnisse, die noch einer genaueren Prüfung Stand halten müssen, finden wir jedoch Unterschiede bezüglich der Frachtspezifität der Vesikel, was für eine differenzielle Rollenverteilung für COPI im sekretorischen Transport spricht. Zuletzt wurden mit Hilfe von reinstem rekombinanten Coatomer elektronenmikroskopische Strukturanalysen gestartet. (iii) Um Funktionen der ArfGAP-Aktivität während der COPI Vesikelbiogenese näher zu beleuchten, zeigen wir mit rekombinantem ArfGAP1, dass bereits katalytische Mengen des Enzyms die Ausbeute an umhüllten Vesikeln drastisch reduzieren. Dies ist in Übereinstimmung mit der bisher angenommenen Funktion dieses Enzyms als Mediator der ‚Uncoating‘ Reaktion. Darüber hinaus wurden Diskrepanzen in der Literatur bezüglich der genauen Funktion von ArfGAP1 untersucht, und im Lichte von neueren Erkenntnissen erklärt.

Translation of abstract (English)

COPI vesicles are defined by a coat consisting of (i) the small GTPase Arf1 and (ii) coatomer. Arf1 in its GTP-loaded form recruits coatomer to the membrane to form a COPI vesicle. GTP hydrolysis leads to uncoating, and is catalyzed by (iii) ArfGAP-activity. In this work we studied the molecular contributions of the named three key players in order to further elucidate the mechanisms underlying COPI vesicle biogenesis and functions: (i) We show that Arf1-GTP induces positive membrane curvature, and find that the small GTPase can dimerize on the membrane. Investigating a possible link between Arf1 dimerization and curvature formation, we isolated an Arf1-mutant (Arf1-Y35A) that cannot dimerize. Although it was capable to exert the classical role of Arf1 as a coat receptor, it could not mediate the formation of COPI vesicles and is lethal in yeast. Strikingly, this mutant was not able to deform membranes, suggesting that GTP-specific dimerization of Arf1 is a critical step which induces membrane curvature during the formation of coated vesicles. We observed that, while the curvature in the budding zone of a COPI vesicle is mediated by coatomer, Arf1 contributes to membrane tension in such a way that fission can occur. (ii) The heptameric coat complex coatomer exists in four isoforms, defined by their γ1/γ2 and ζ1/ζ2 subunits, which are distributed differentially over the Golgi. Here we show a biochemical characterization of the four recombinant isoforms of the heptameric complex. We demonstrate that the recombinant protein complexes yield COPI-vesicles in vitro with an efficiency comparable to coatomer isolated from tissue. (iii) To investigate roles of ArfGAP activity during in vitro budding, we find that catalytic amounts of full length ArfGAP1 reduce the yield of COPI-coated vesicles significantly, in line with the proposed function of the enzyme to mediate the uncoating reaction. We also experimentally addressed discrepancies in the literature about the role of ArfGAP1 during COPI-vesicle formation.