Preview

PDF, English Download (5MB) | Terms of use

Abstract

Insulin analogues have been developed with the aim to provide better glycaemic control to diabetic patients. They are generated by modifying the insulin backbone which, however, may alter relevant biochemical characteristics such as the affinity to insulin receptor and type I insulin-like growth factor receptor (IGF-IR), and the insulin receptor dissociation rate. As a result insulin analogues may exhibit stronger mitogenic potency than regular insulin. Normal mammary epithelial cells show high expression of insulin receptor and IGF-IR and mammary cancer cells frequently even show overexpression of both receptors, thus suggesting mammary epithelial cells to be a sensitive target for insulin analogue - mediated proliferation. Indeed, treatment of female Sprague-Dawley rats with the insulin analogue B10Asp resulted in strong increase in the incidence of mammary tumours. Of all the insulin analogues available nowadays for therapeutical use, a standard two-year carcinogenicity study has been performed only for Insulin Glargine (Lantus®). The study showed similar incidence of mammary tumours in rats treated with Insulin Glargine or normal insulin. However, this study reported a very high mortality rate in all experimental groups thus raising questions on the conclusions drawn. In vitro studies on the effect of insulin analogues on mammary cell lines are scarce and lack comprehensiveness. In addition, the biochemical mechanism of the proliferative effect of the insulin analogues has not been clarified. This thesis aimed to study and compare in detail the proliferative potency of insulin analogues available for therapeutical use in insulin responsive mammary epithelial cell lines and to clarify the molecular and biochemical mechanism behind the proliferative potency. The role of insulin receptor, IGF-IR and related signalling pathways was analysed for the insulin analogue showing the strongest proliferative effect in comparison to regular insulin. Among a panel of seven mammary epithelial cell lines, MCF7 (a tumour cell line) and MCF10A (a benign cell line) showed the strongest insulin response. Proliferation assays on MCF10A cells demonstrated equipotency of four insulin analogues (Insulin Aspart, Insulin Lispro, Insulin Glargine and Insulin Detemir) to regular insulins (human and bovine insulin). However, proliferation assays performed in MCF7 cells revealed that Insulin Glargine induced significantly stronger proliferation than regular insulin and the other three insulin analogues. This finding was corroborated by BrdU incorporation studies in MCF7 cells. Activation of the two insulin-related signalling pathways - PI3K and MAPK pathway - was determined by studying the phosphorylation status of key signalling molecules (Akt and GSK3α/β for PI3K and Erk1/2 for MAPK pathway). In MCF10A cells, all insulin analogues were equipotent to regular insulin in inducing phosphorylation of GSK3α/β and Erk1/2. Interestingly, Insulin Glargine induced significantly higher phosphorylation of Akt in comparison to regular insulin in MCF10A cells. On the contrary, in MCF7 cells, Insulin Glargine induced strong phosphorylation of the three signalling molecules studied. The signalling potency of Insulin Glargine was significantly stronger than that of regular insulin and all other insulin analogues. Use of specific inhibitors showed that MAPK is the major proliferation pathway activated by Insulin Glargin in MCF7 cells. In order to determine the contribution of insulin receptor and IGF-IR to the strong mitogenic potency of Insulin Glargine, the RNAi technique was utilized to specifically target insulin receptor and IGF-IR. Study of signalling pathways and proliferation under knockdown conditions clearly demonstrated the activation of IGF-IR by Insulin Glargine whereas the other compounds activated the insulin receptor. Thus, the increased proliferative ability of Insulin Glargine in comparison to regular insulin is the result of IGF-IR activation. IGF-IR immunoprecipitated from cells treated with Insulin Glargine or regular insulin showed much higher tyrosine phosphorylation levels in the Insulin Glargine - treated cells, which substantiates the findings from the knockdown experiments. Moreover, analysis of expression levels of cyclin D1, an IGF-I responsive gene, by quantitative RT-PCR showed higher expression levels in MCF7 cells treated with Insulin Glargine than in cells treated with regular insulin, again corroborating the strong activation of IGF-IR by Insulin Glargine. In order to clarify the potential activation of the established cross-talk between insulin receptor/IGF-IR and estrogen receptor-α (ERα) by insulin analogues, we determined the activation of ERα by analysing the phosphorylation status of Ser118 at ERα as well as ERE-dependent luciferase gene expression. In comparison to regular insulin, Insulin Glargine induced significantly stronger phosphorylation of ERα at Ser118 and slightly higher luciferase activity. However, since ERα was only weakly activated by Insulin Glargine, modulation of ERα activity is unlikely to play a strong role in rendering high proliferative ability to Insulin Glargine. Finally, the possible tumour-promoting potential of Insulin Glargine was studied by wound healing, transwell and matrigel assays. The assays demonstrated similar migration-inducing potential of Insulin Glargine and regular human insulin in MCF7 cells. In summary, this study shows that different from regular insulin and other insulin analogues studied, which activate the insulin receptor and the PI3K pathway, Insulin Glargine activates the IGF-IR and the MAPK pathway too, and is a strong mitogen in breast cancer cells showing high IGF-IR expression. Insulin Glargine may therefore be of risk for patients with breast cancer or as yet undetected (pre-) cancerous lesions.

Translation of abstract (German)

Insulinanaloga wurden entwickelt mit dem Ziel den Blutzuckerspiegel bei Diabetikern besser zu kontrollieren. Insulinanaloga haben im Vergleich zu Normalinsulin eine veränderte Aminosäuresequenz. Dies hat Veränderungen in relevanten biochemischen Eigenschaften zur Folge, z.B. in der Affinität für den Insulinrezeptor (IR) und den Typ-I Insulin-like Growth Factor Receptor (IGF-IR), sowie in der Dissoziationsgeschwindigkeit vom IR. Das Ergebnis kann eine erhöhte mitogene Aktivität der Insulinanaloga im Vergleich zu Normalinsulin sein. Normales Brustdrüsenepithel zeigt eine starke Expression von IR und IGF-IR, und Brustkrebszellen zeigen häufig sogar eine Überexpression beider Rezeptoren. Aus diesem Grund ist das Brustdrüsenepithel ein empfindliches Zielorgan für Insulinanaloga und deren proliferationssteigernde Wirkung. In der Tat resultierte die Behandlung weiblicher Sprague-Dawley Ratten mit dem Insulinanalogon B10Asp in einer signifikanten Zunahme der Inzidenz von Mammakarzinomen im Vergleich zu Normalinsulin. Von allen Insulinanaloga, die heutzutage therapeutisch eingesetzt werden, wurde nur für Insulin Glargin (Lantus®) eine standardisierte zweijährige Karzinogenitätsstudie durchgeführt. In dieser Studie zeigten Insulin Glargin und Normalinsulin keine signifikanten Unterschiede in der Tumorinzidenz. Allerdings wurde eine extrem hohe Mortalitätsrate bei allen behandelten Tiergruppen berichtet, was die Schlussfolgerung, dass Insulin Glargin das Krebsrisiko nicht erhöht, infrage stellt. Es gibt nur wenige in vitro-Studien zur proliferativen Wirkung von Insulinanaloga auf Brustzelllinien und diese sind wenig aussagekräftig. Auch wurde der biochemische Mechanismus der proliferativen Wirkung von Insulinanaloga nicht geklärt. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die proliferative Potenz therapeutisch eingesetzter Insulinanaloga detailliert in insulinresponsiven epithelialen Brustzelllinien zu untersuchen und zu vergleichen und den molekularen und biochemischen Mechanismus der proliferativen Wirkung aufzuklären. Die Rolle des IR und des IGF-IR und der entsprechenden Signal-transduktionswege wurde analysiert für Normalinsulin und das Insulinanalogon, das den stärksten proliferativen Effekt zeigte. Aus einer Gruppe von sieben Zelllinien zeigten MCF7 Zellen (eine Tumorzelllinie) und MCF10A Zellen (eine benigne Zelllinie) die stärkste proliferative Antwort auf Insulin. In Proliferationsassays mit MCF10A Zellen zeigten die vier untersuchten Insulinanaloga (Insulin Aspart, Insulin Lispro, Insulin Glargin und Insulin Detemir) gleich starke Wirkung wie Normalinsulin (menschliches Insulin und Rinderinsulin). In Proliferationsassays mit MCF7 Zellen induzierte Insulin Glargin jedoch eine signifikant stärkere Proliferation als Normalinsulin und die anderen drei Insulinanaloga. Dieser Befund wurde durch BrdU-Inkorporationstests an MCF7 Zellen bestätigt. Die Aktivierung der beiden durch Insulin stimulierten Signalwege – PI3K und MAPK Signalweg – wurde durch Bestimmung des Phosphorylierungsgrads wichtiger Signalmoleküle (Akt und GSK3α/β für den PI3K-Weg und Erk1/2 für den MAPK-Weg) untersucht. In MCF10A Zellen war die Phosphorylierung von GSK3α/β und Erk1/2 nach Behandlung mit allen Insulinanaloga und Normalinsulin gleich stark. Interessanterweise war jedoch die Phosphorylierung von Akt nach Insulin Glargin - Behandlung signifikant stärker als nach Behandlung mit Normalinsulin. In MCF7 Zellen verursachte Insulin Glargin eine sehr starke Phosphorylierung aller drei Signalproteine. Diese war signifikant stärker als bei Normal-insulin und den anderen Insulinanaloga. Die Verwendung spezifischer Inhibitoren in Proliferationsassays ergab, dass Insulin Glargin in MCF7 Zellen hauptsächlich den MAPK-Weg aktiviert. Um die Rolle von IR und IGF-IR bei der starken mitogenen Aktivität von Insulin Glargin zu klären, wurden IR und IGF-IR durch RNAi-Technik jeweils spezifisch herunterreguliert. Die Aktivierung der Signalwege und Proliferation unter Knockdown-Bedingungen ergab eindeutig, dass Insulin Glargin den IGF-IR aktiviert, während die anderen Substanzen den IR aktivieren. Daraus folgt, dass die erhöhte proliferative Aktivität von Insulin Glargin auf der Aktivierung des IGF-IR beruht. Immunpräzipitation des IGF-IR und anschließende Analyse des Tyrosinphosphorylierungsgrades zeigten eine wesentlich stärkere Phosphorylierung in Zellen, die mit Insulin Glargin behandelt worden waren. Dies erhärtet die Befunde aus den Knockdown-Experimenten. Weiterhin wurden die Expressionsspiegel von Cyclin D1, eines IGF-I Zielgens, durch quantitative RT-PCR bestimmt. Sie ergaben eine höhere Expression von Cyclin D1 in Insulin Glargin - behandelten Zellen im Vergleich zu Normalinsulin. Dies bestätigt noch einmal die Aktivierung von IGF-IR durch Insulin Glargin. Um zu klären, ob Insulinanaloga möglicherweise den bekannten Cross-talk zwischen IR/IGF-IR und Estrogenrezeptor-α (ERα) aktivieren, wurde sowohl die Zunahme des Phosphorylierungsgrads von ERα an Ser118 als auch die Induktion der ERE-abhängigen Luciferasegenexpression bestimmt. Im Vergleich zu Normalinsulin induzierte Insulin Glargin eine signifikant stärkere ERα-Phosphorylierung an Ser118, aber nur eine leichte Steigerung der Luciferase-Aktivität. Da der ERα durch Insulin Glargin nur schwach aktiviert wurde, ist es unwahrscheinlich, dass dieser Mechanismus wesentlich zur starken mitogenen Wirkung von Insulin Glargin beiträgt. Zum Schluss wurde durch Wundheilungs-, Transwell- und Matrigel- Assays geprüft, ob Insulin Glargin tumorpromovierendes Potential besitzt. Die Tests ergaben eine ähnliche migrationssteigernde Wirkung von Insulin Glargin und Normalinsulin in MCF7 Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Normalinsulin und drei der untersuchten Insulinanaloga den IR und den PI3K-Signalweg aktivieren. Insulin Glargin aktiviert außerdem den IGF-IR und den MAPK-Signalweg und stellt ein starkes Mitogen in Brustkrebszellen dar, welche eine hohe IGF-IR Expression aufweisen. Möglicherweise birgt deshalb die Behandlung mit Insulin Glargin ein Risiko für Brustkrebspatientinnen und für Frauen mit bisher nicht entdeckten Tumoren oder Tumorvorstufen.