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Microarray-Technologie zur Bestimmung der DNA-Bindungsspezifitäten krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren

Krauß, Christian

English Title: Determination of DNA-binding-specificities of cancer related transcription factors using Microarray Technology

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PDF, German
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Abstract

Ziel der hier vorliegenden Arbeit war Entwicklung und Etablierung einer auf Microarray basierenden Methode zur Bestimmung von Protein-DNA-Wechselwirkungen im Hochdurchsatz-Format. Hierzu wurde die Geniom-Plattform in Zusammenarbeit mit der febit biomed GmbH weiterentwickelt und für diese Experimente etabliert. Im ersten Teil der Arbeit stand die Entwicklung der Methode anhand des Transkriptionsfaktors Gli2 sowie ein Validierung der Ergebnisse mit anderen Methoden im Vordergrund (SPR und QCMD-Technologie). Im zweiten Teil der Arbeit wurden mit dieser Methode die Bindungsspezifitäten von 10 krebsrelevanten Transkriptionsfaktoren bestimmt. Ausgehend von der aus der Literatur bekannten Konsensus Sequenz wurden alle möglichen Ein- und Zweibasenpaarmutationen dieser Transkriptionsfaktoren untersucht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass die hier entwickelte Methode für die Messung von Protein-DNA-Wechselwirkungen im “high throughput” Format angewendet werden kann. Dies wurde als “proof of principle” anhand des Transkriptionsfaktors Gli2 mit zwei verschiedenen Tags sowie für 10 weitere Transkriptionsfaktoren gezeigt. Es konnten hierbei innerhalb der Bindemotive Gemeinsamkeiten aufgezeigt werden. Bei den C2H2-Zink-Fingerproteinen Gli2 und WT1 ist hauptsächlich die Base Cytosin für die DNA Bindung verantwortlich. Auch ein Vergleich der Sequenzlogos mit anderen aus der Literatur bekannten Zinkfingern wie Zif268 zeigt eindeutige Übereinstimmungen. Auffällig war weiterhin das Vorkommen von Kernsequenzen mit einer Länge von 2-3 Basenpaaren in der Mitte der Bindesequenz, die maßgeblich für die Bindung verantwortlich sind. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass bei den meisten Transkriptionsfaktoren der Austausch dieser Basen hinsichtlich der Proteinbindung als besonders kritisch anzusehen ist. Dies lässt sich durch strukturelle Veränderung in der DNA erklären. Die Bindung des Proteins an die Bindedomäne funktioniert ähnlich dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. Für die Spezifität und Stabilität der Bindung sind Wasserstoffbrücken, Ionenbindungen sowie hydrophobe Wechselwirkungen verantwortlich. Wird dieses perfekt aufeinander abgestimmte System verändert und die Struktur des DNA bindenden Motivs passt nicht mehr exakt zu der Form der DNA, ist die Affinität reduziert. Leicht vorstellbar ist dies beispielsweise bei einem Austausch eines Pyrimidins gegen ein Purin. Auch der gegenteilige Fall ist denkbar. Es ist also durchaus erklärbar, dass auch stärker bindende Sequenzen als die Konsensus-Sequenz gefunden wurden. Die häufigste natürlich vorkommende Bindesequenz muss nicht unbedingt die Stärkste sein. Wichtig ist, dass sie schnell und effektiv regulierbar ist. Mutationen in der Bindesequenz von Transkripionsfaktoren können somit weitreichende Folgen haben. Bis jetzt sind jedoch nur wenige Mutationen in diesen Regionen bekannt, die Krankheiten wie Krebs verursachen können. Mit den aus dieser Arbeit gewonnenen Daten können Vorhersagen getroffen werden, wie sich verschiedene Mutationen in den Promoterregionen hinsichtlich der Proteinbindung und somit auch auf die Expression auswirken können.

Translation of abstract (English)

The aim of this thesis was the development of a microarray-based method to determine protein-DNA interactions in a high-throughput manner. For this purpose, the Geniom platform was be established and refined for transcription factor binding studies in a cooperation with febit biomed GmbH. Initially the development and establishment of these method was performed using the MBP-3Myc-Gli2 fusion protein. These results were also validated using SPR- and QCMD-technology. In the second part of this thesis, the assay was used to determine the binding specificities of ten transcription factors, which are associated with cancer. The results obtained in this work reveal that the established method can be used routinely for the measurement of protein-DNA interactions in a high-throughput format. This was shown as a proof of principle for the MBP-3xMyc-Gli2 fusion protein and for ten other transcription factors. Additionally, we found similar core sequences within the binding motives. For the C2H2 zinc finger proteins Gli2 and WT1 basically the base cytosine is responsible for the DNA binding. We have also found core sequences with a length of 2-3 bases in the middle of the binding sequence, which were very important for the binding. Furthermore, the results show that a substition of one of these sequences is very critical with respect to binding. The binding of the protein to the dsDNA operates similar to the “Lock-and-Key Principle”. Hydrogen-bridges, ion-binding and hydrophobic interactions are responsible for the specificity and stability of the binding. This is a very accurate system, perfectly coordinated. Is this system, slightly changed, the affinity can be reduced. But not a decreasing of the affinity is possible, also an increase was observed. The most abundant natural sequence is not necessarily the strongest one. It is important that this sequence is adjustable fast and effective. Mutations in this binding sequence might have far-reaching consequences. Until now only a few mutations are known which might be cancer-relevant. With the data obtained in this work, a prediction can be made how different mutations in the promoter regions can affect protein binding and gene expression.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Wolfrum, Prof. Dr. Jürgen
Date of thesis defense: 20. March 2009
Date Deposited: 25. Mar 2009 13:29
Date: 2008
Faculties / Institutes: Fakultät für Chemie und Geowissenschaften > Institute of Physical Chemistry
Subjects: 540 Chemistry and allied sciences
Controlled Keywords: Microarray, DNS-Chip
Uncontrolled Keywords: Transkriptionsfaktoren , FebitDNA-Microarray , Transcription Factor , Febit
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