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Herstellung und Anwendung von hochkomplexen Peptidbibliotheken

Block, Ines

English Title: Generation and Application of highly complex peptide libraries

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PDF, German
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Abstract

Die Fähigkeit von Proteinen physische Interaktionen mit anderen Proteinen und Biomolekülen einzugehen bildet eine wichtige Grundlage ihrer Funktion im menschlichen Organismus. Störungen in diesen Interaktionen können Fehlfunktionen in den beteiligten Signal- oder Stoffwechselwegen hervorrufen und letztlich zu Krankheit und Tod führen. Für das molekulare Verständnis der beteiligten Prozesse ist es wichtig, die Protein-Interaktionen im Detail zu studieren. Neben genetischen, zellbiologischen und komplexen biochemischen Ansätzen gewinnen Array-basierte Verfahren zur systematischen Suche nach Protein-Interaktionspartnern zunehmend an Bedeutung. Die Nutzung von entsprechenden Protein- und Peptid-Arrays wird derzeit aber noch durch deren schlechte Verfügbarkeit erschwert. Peptidarrays, die sich hervorragend für die Hochdurchsatzsuche nach Agonisten und Antagonisten und somit für die Entwicklung von peptidischen Wirkstoffen eignen, werden bis dato kommerziell nach dem etablierten SPOT-Verfahren mit Arraydichten von 25 Peptiden pro cm2 gefertigt. Um die Komplexität der Peptidarrays zu steigern und die hohen Kosten der Peptidsynthese zu senken, wurde in der Arbeitsgruppe Chipbasierte Peptidbibliotheken (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg/Deutschland) eine neue Synthesetechnik entwickelt. Dieses Verfahren beruht auf Aminosäurepartikeln, in deren Matrix die Aminosäuren für die kombinatorische Peptidsynthese eingebettet sind. Die Partikel werden mit einem modifizierten Laserdrucker oder durch Einsatz von speziellen Mikrochips an die Syntheseorte auf dem Array gebracht. Anschließend wird der Träger erhitzt, wodurch sich die Partikelmatrix verflüssigt und die Kopplung der Aminosäuren an den Träger initiiert wird. Durch wiederholtes Ablagern, Koppeln und Waschen können die gewünschten Peptidbibliotheken kombinatorisch erzeugt werden. Die Methode übertrifft den Stand der Technik bezüglich ihrer Komplexität mit bis zu 400 Peptidspots/cm2 für den Laserdrucker und mit 10.000 - 40.000 Peptidspots/cm2 für den Mikrochip um ein Vielfaches und das bei deutlich geringeren Herstellungskosten. Vor der Etablierung der Synthesemethode und der breiten Nutzung der „gedruckten“ Peptidarrays sollten diese zunächst im Rahmen meiner Arbeit umfassend charakterisiert werden. In biologischen, medizinischen und biotechnologischen Modellanwendungen sollte zudem die Verwendung der Peptidarrays als funktionelles Werkzeug getestet werden. In Phosphorylierungsexperimenten wurden Substratpeptide unterschiedlicher Kinasen, darunter die cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und c-Src, kombinatorisch synthetisiert und auf dem Array phosphoryliert. In Übereinstimmung mit der Literatur wurde durch die PKA primär die Serin-Seitenkette phosphoryliert, wenn diese in der Erkennungssequenz RRXS (X = variable Aminosäure) vorlag. Durch diesen Versuch wurde die Anwendbarkeit der mit Hilfe von festen Aminosäurepartikeln synthetisierten Peptidarrays zur Identifizierung von spezifischen Proteinkinasesubstraten belegt. Die Experimente zur Suche nach katalytisch aktiven Peptiden beruhten auf Studien von Berkessel et al. die komplexbildende Peptide und Peptidderivate identifiziert hatten, welche die hydrolytische Spaltung von Phosphorsäureestern katalysieren. Trotz umfangreicher Versuche konnten diese Ergebnisse allerdings nicht auf die von uns synthetisierten Peptidarrays übertragen werden. Die durch die hydrolytische Spaltung entstehenden gefärbten Reaktionsprodukte konnten nicht eindeutig nachgewiesen und damit eine katalytische Aktivität der metallhaltigen Peptidderivate nicht belegt werden. In einem weiteren Modellversuch wurde nach metallbindenden Peptiden gesucht, die bspw. in der Nuklearmedizin eingesetzt werden können. Viele Radiopharmazeutika enthalten das metastabile 99mTechnetium, das als metallorganischer Komplex an ein bioaktives Molekül zur Erkennung einer Zielstruktur gebunden ist. Um [99mTc(H2O)3(CO)3]+-bindende Peptide zu identifizieren, wurde ein Hexapeptid-Array mit 133.224 individuellen Peptidspots (XAs1As2As3As4X; X= Aminosäuregemisch) auf einer chemisch modifizierten Glasplatte (21 x 22 cm2) unter Verwendung des Peptidlaserdruckers hergestellt. Die Peptidbibliothek wurde nach [99mTc(H2O)3(CO)3]+- und - als Kontrolle - nach 99mTcO3+-bindenden Peptiden durchsucht. Mit der Einschränkung, dass in der ersten und letzten Position der identifizierten Hexapeptide noch ein Gemisch von Aminosäuren vorliegt und eine abschließende Verifizierung der Resultate (z.B. HPLC) noch aussteht, wurden Peptidkandidaten bestimmt, die den Technetiumcarbonylkomplex stabil binden. Die Untersuchungen unterstreichen das Potential der „gedruckten“ Peptidarrays als Werkzeug zur Identifizierung von medizinisch relevanten Metall-Peptid- Komplexen. In einem weiteren Projekt wurde die grundsätzliche Realisierbarkeit der kombinatorischen Peptidsynthese auf einem Mikrochip anhand einfacher immunologischer Anwendungen dokumentiert.

Translation of abstract (English)

Proteins ability to physically interact with other proteins or biomolecules provides the essential basic of protein function in human organisms. Interferences of these interactions can result in male-function of engaged signal transduction and metabolic pathways finally causing diseases and death. Protein interactions have to be studied in detail to understand molecular basis of involved processes. In addition to genetic, cell biological and complex biochemical approaches array-technologies become more important for systematically identification of protein interaction partners. Usage of such protein and peptide arrays is still limited by low availability. Peptide arrays, which are appropriate tools for high-throughput-screenings of agonists and antagonists and therefore for development of drugs, are commercially generated by established SPOT-synthesis techniques resulting in array densities of 25 peptides per cm2. Therefore, at the German Cancer Research Center (Heidelberg/Germany) a novel method was developed to synthesise peptide arrays with higher complexities and low expenditures of time and material resulting in significant reduced manufacturing costs. This technique is based on solid amino acid particles whereby the particles consist of one pre-activated L-amino acid and several other additives embedded in a solid matrix. These particles can be addressed to defined reaction regions of a solid supports by either a custom-built laser printer or specific microchips. Afterwards by heating the support the particle matrix liquefies and initiates coupling of the amino acids onto chemical modified supports. Repetitive addressing, coupling and washing cycles finally result in the combinatorial synthesis of a peptide array. This novel method outperforms established synthesis techniques regarding their complexity of 400 peptide spots per cm2 in case of laser printing and 10,000 – 40,000 peptide spots using the microchip approach whereby production costs were minimized. Prior to establishing this novel synthesis method peptide arrays should be comprehensively characterized and usefulness evaluated in different model applications. Specific peptide substrates of different kinases e.g. cAMP-dependent protein kinase (PKA) and c-Src were combinatorially synthesized and phosphorylated. In accordance with literature the specific phosphorylation of serine embedded in the recognition sequence RRXS (X = variant amino acid) by cAMP-dependent protein kinase could be detected. This example proofed the usefulness of the novel peptide array synthesis using solid amino acid particles for the identification of specific kinase substrates. Experiments for the identification of catalytic active metallopeptides are based on results achieved by Berkessel et al., who identified specific metal-peptide complexes and metal binding peptide derivates catalyzing hydrolytical cleavage of phosphate esters and phosphodiesters. Despite intensive experiments all attempts were in vain to apply this approach to the synthesized peptide arrays. The stained reaction products were not detected unambiguously, which is why specific catalytic activity of tested metallopeptides could not be verified. Further model approaches yield in identification of metal binding peptides, which can be used in nuclear medicine. Radiopharmaceuticals often contain the metastable 99mTechnetium bound to a bioactive molecule as organometallic complex, which recognizes a target structure. For the identification of new [99mTc(H2O)3(CO)3]+-binding peptides, a hexapeptide library with 133,224 peptide spots was generated on a chemically modified glass support (21 x 22 cm) with the laser printer. Although the first and last amino acids of the hexapeptides were not identified and final verification of results (e.g. HPLC) is not completed by now, specific peptide candidates were identified, which bind [99mTc(H2O)3(CO)3]+ or -as a matter of reference- 99mTcO3+ under given reaction conditions. The results provide evidence for the usefulness of our new peptide arrays synthesized via a laser printer for the development of medical relevant metal-peptide complexes. In a further proof-of-concept experiment the essential feasibility of combinatorial synthesis on a microchip was documented by simple immunoassaying.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Bischoff, Dr. PD Ralf
Date of thesis defense: 24 March 2009
Date Deposited: 24 Mar 2009 15:33
Date: 2009
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
Controlled Keywords: Peptidsynthese, Kombinatorische Synthese, Laserdrucker, Chip
Uncontrolled Keywords: combinatorial peptide synthesis , peptide laser printer , microchip
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